λ噬菌体基因组DNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书.doc

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λ噬菌体基因组DNA快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书

◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用,仅用于体外 ◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用,仅用于体外 ◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ ◆ 使用手册 ◆ 实验室使用,仅用于体外 λ噬菌体基因组DNA快速提取试剂盒 目录号:D目录编号 包装单位 D01 50次 D02 100次 适用范围: 适用于快速λ噬菌体DNA 试剂盒组成、储存、稳定性: 试剂盒组成 保存 50次 100次 RNase A -20℃ mg 20 mg X 2 DNase I -20℃ 50 mg 50 mg X 2 噬菌体沉淀液 室温 100 ml 00ml X 2 裂解缓冲液 室温 30 ml 0 ml 杂质沉淀液 室温 5 ml ml 结合液LB 室温 20 ml 40 ml 漂洗液WB 室温 15 ml ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液EB 室温 10 ml ml 吸附柱AC 室温 50个 100个 收集管(2ml) 室温 50个 100个 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。储存事项: 在RNase A管和DNase I管分别加入毫升的裂解缓冲液吹打,颠倒混匀,充分溶解RNase A和DNase I后,分装-20℃冻存,有效期6个月。 结合液LB低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。产品介绍: λ噬菌体载体广泛用于文库筛选,目的克隆培养获得大量的噬菌体颗粒需要提取λ噬菌体DNA来开展测序等后续工作。λ噬菌体裂解培养物离心后的上清,首先用RNase A /DNase I混合酶消化去除残留的宿主菌DNA/RNA,沉淀收集噬菌体,噬菌体被SDS裂解,残留碎片通过沉淀离心去除掉。裂解物上清中的λ噬菌体DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将λ噬菌体DNA从硅基质膜上洗脱。 产品特点: 不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。 节省时间,简捷,可用于液体培养裂解物和固体培养板的提取,单个样品操作一般可在1.5小时内完成。 产量高,典型的产量10ml λ噬菌体裂解培养物上清可以提取10μg λ噬菌体DNA。 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9。可以直接用来酶切和测序。 注意事项 使用转速可以达到13,000rpm的冷冻离心机。 开始实验前将需要的水浴先预热到℃备用。 需要自备氯仿,20%SDS。 结合液LB含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。 操作步骤(实验前请先阅读注意事项)以10 ml噬菌体感染细菌培养上清提取举例提示: 第一次使用前请先在漂洗液WB中加入无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入! 将噬菌体沉淀液放在冰上预冷。 将0.5%氯仿处理后的λ噬菌体感染的液体培养物10,000g(12,000rpm) 4℃离心10分钟去除细胞碎片和残渣。 转速不能过高,时间不能过长,否则噬菌体可能和碎片一起沉淀,降低产量。 取10ml上清,加入0μl RNase和20μl DNase充分混匀37℃温育30分钟。加入2 ml 冰预冷的噬菌体沉淀液,轻柔混匀后置冰上(培养板裂解物必须在冰上放置30分钟)。 10,000g(12,000rpm)4℃离心10分钟,弃上清,干燥1分钟。沉淀下来的噬菌体外观为透亮或者稍白的沉淀。 加入500μl裂解缓冲液,吹打重悬噬菌体,加入100μl 20%SDS,立即轻柔颠倒混匀4-6次后,70℃温育0分钟,然后置冰上冷却。 加入100μl杂质沉淀液,立即轻柔颠倒混匀4-6次,最高速13,000g 4℃离心10分钟。 仔细将上清转入新的离心管,加入350μl结合液LB,轻柔涡旋混匀。 将上述混合物加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)1,000rpm离心秒,倒掉收集管中的废液。 吸附柱一次最多只可以容纳大约700μl混合物,因此需要分次把混合物上到吸附柱内,重复步骤8。 加入00μl漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm 离心30秒,弃废液。 将吸附柱AC放回空收集管中,1,000rpm离心分钟,尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管

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