基因组DNA提取方法及进展.pdf

MrrI 上—星堕芏监壁垒壶!Q业至璺l!鲞蔓§堂ilt些gl·!』uf 文章编号：IilOl2087(2002)060379．113 中围分类号：078I 文献标识码：A 基因组DNA提取方法及进展 王龙武1。二，徐克前二， 罗识奇I (1湖南省临床检验巾心，长沙410008；2中南大学湘雅医学院检验系，长沙410008) 关键词：譬H细I)NA；提取 随着分于牛物学技术的屯速发罹．基冈分析血临床上 桉．用细胞裂解}随他白细胞释放I)NA用蛋白酶K【“、蚩自 的啦用fI趋广泛．日动化程度极高的分析仪器相继问f}f-使酶一‘、蛋白酶K和梭糖枝酸酶和强碱(NaOH或KOH)I“ 基罔分柝枝术领域得刮迅速发展．但作为基因分析的关键 等对蛋白质和RNA进行允分消化分解。在高盐的条件下用 步骤剧甚同组DNA提上Il(和纯化直足耗时．繁琐的过程，乙醇直接沉淀分离纯化DNA。避免r他用有毒作用的有 f{自动ft槲度小高，严电减慢J’基因分析的谴度。基因组 8【I 机溶剂，提取的DNA纯度较高，A驯Ⅲ／AⅢh．．选纠I 1)NA提且z和纯化^法的灵敏度、特芹胜直接影响基因分析r．DNA提胞效率高，可达20一28ftg／ml。但篮白酶对蛋 的结粜 所姒，许多学肯 自托努力探索各种是山组DNA 白质消化需要很长时Iuj或需苜高韫条件下进行消化，给临 的提躯疗}士、 床J世用．特别是常规应用带来了～定的射难， ·挂幽绀I)NA经帆提取法““ 三、以一氧化硅为同相吸附剂的基出组I)NA提取涪 外周血皋l叫_ellI)NA提取分为四个步嫌：1分离向细 姒二氧化砗作固丰日吸附剂提取DNA的作用机理：在 眦，采阡|Ficnll 般 I}yl州1㈣榔受离心分离外周血白细胞． pH值等卜或低于二氧化吐表面Pka值的高离f强度缓冲 簋求mL样际奉丛^，通常需5、lOrnl，不适用于儿科病人。液中．■氧化硅表向的负电苘减少，I)NA分子箝，白的负电 也“JjH仑血A摧注加低渗缓冲液破坏红细胞而保持白细胞荷与一氧化硅表面产生的排斥力减小。形成了大量的水台 形态或f帛斛细胞核完整，离心收集白细胞和绌胞核。这种 离干，DNA分r的水合程度降低而被驱使秉☆到二氧化耐： 方}土Hf mI譬小．操作桕对简便。2裂斛向细胞，用剐胞裂 n0表面J，。同时细胞裂解剖也丁扰双链DNA分子问的氢 帮瑷川一澶裂觯I。1钏胞释放卅幕H组DNA。根据使用的细 健形成而产生单链DNA分，．DNA单链分子与一氧化硅 胞裂斜剂的小同仃I矗氯酸钠法、sI)s法、DAlB法、Nal法、 表向形成氢键，这种氢键力远大于I)NA分子与一氧化辞丧 昧豪提取珐厦KI?尢 “等，加人蛋白酶K使蛋白厦分 面的静电排斥力，如鬃pH值低f…氧化硅表面I，ka值，这 解，肯I‘j脚K价恪F_5炙“学占“用胰蛋向腑代替篮一酶K 种静电排斥山会更小，这样人大促进二氧化硅表面对DNA 啊样取缁J+满意的钻果；3有机溶剁抽捉，用酚／氙仿进行 分了：的吸刚能力。但pH值太低会影响蛋白质和脂质的nr 椭提』际置¨睫与m红素等杂质；4沉淀分离bNA．将卜溶性，产生沉淀T扰实验，所以该宴啼成功的关键是维持 进处删的】)NAf口二阵沉淀或透忻等力法进 步纯化， 6 7)…J。吸附仃】jNA分子的～氧化 情当的囊验条什(pH 1)N、的纯慢祠j爵甘删定采川比包法，A紫外分光光度硅用洗涤液洗掉啦附在二氧化硅表f『『『的其它杂质，用p¨ 8 if}_