微生物实验八演示.pdf

实验八 食品微生物的检测、分离纯化和初步鉴定 （综合实验） [ 目的要求] 1. 检索并了解国家相关的食品卫生标准，了解细菌总数，霉菌总数、 酵母菌总数，大肠菌群数在食品卫生学评价中的意义； 2. 学习并完成实验设计； 3 ．应用细菌的分离和活菌计数的基本方法、掌握相关原理； 4 ．对分离到的微生物（细菌，霉菌）进行初步的形态学观察，对分 离的细菌进行鉴别染色以及生化鉴定； 5. 学习和掌握快速大肠菌群检测纸片的检测方法； [基本原理] *细菌总数（菌落总数），霉菌和酵母菌总数是反映样品的卫生质 量的微生物学指标。（36 ±1 ℃恒温箱中, 48 ±2h） *大肠菌群：一类好氧和兼性厌氧、在乳糖培养基中经 37 ℃、24h-48 h 培养产酸产气、G-、无芽孢杆菌, 是常用的粪便污染指示菌，可反 映样品污染的可能性和程度。 *检测大肠菌群的方法: 多管发酵法、微孔滤膜法和纸片法。本 实验讲解快速大肠菌群检测试法。 *大肠菌群检测纸片的原理： (1) 滤纸片含营养物质、指示剂以及 G+抑制剂；（乳糖，蛋白胨、 胆盐、TTC （氯化三苯基四氮唑）、NaCl 、K HPO 、溴甲酚紫） 2 4 大肠菌群:琥珀酸脱氢酶 （2 ）. TTC （无色）非水溶性的红色三苯甲脂 酸性条件下 （3 ）. 溴甲酚紫：黄色 （4 ）.查表：大肠杆菌 MPN(Most Probable Number, 最可能数)表, 得到数据乘稀释倍数，以此为结果，报告 100ml 检样内大肠菌群的 MPN 值。 结果判断说明: 纸片上出现红色斑点, 外周黄晕或纸片产生黄色 背景, 并在黄色背景上出现红色斑点或片状黄晕者为阳性; 纸片上 呈均匀紫蓝色者为阴性; 纸片呈紫蓝色, 有红点周围无黄晕或酸性 样品接种后纸片变黄, 经培养无红点者为阴性。检测纸片为一次性使 用,使用后焚烧处理。 *霉菌和真酵母菌的检测 虎红培养基（孟加拉红培养基，虎红琼脂，Rose Bengal Agar， 检测霉菌及酵母总数。 该培养基中的孟加拉红和抗菌素具有抑制细菌的作用。孟加拉红 还可抑制霉菌菌落的蔓延生长。在菌落背面由孟加拉红产生的红色有 助于霉菌和酵母菌落的计数。 28℃恒温箱中, 3 天后开始观察，共培养观察 5 天，计数。 [实验材料] 食品检样、培养基、无菌（生理盐）水、无菌培养皿，无菌移液 管等。 [方法和步骤] 1． 选定检测的饮料等食品（原则：经济；有意义）； 2． 检索国家或者地区、行业相应卫生标准； 3． 根据 1、2 项内容自行设计实验方案； 4． 统计检测食品中的细菌总数，霉菌总数，大肠菌群数，并分离 细菌； 5． 对分离到的细菌进行形态学观察； 6． 对分离到的细菌进行革兰氏染色分析； 7． 对分离到的细菌进行部分生物化学鉴定； 参考步骤 一、样品稀释及培养 1．取样、稀释和培养 1.1 以无菌操作取检样，制成 1:10 的均匀稀释液。 1.2 用 1ml 灭菌吸管吸取 1:10 稀释液 1ml，沿管壁徐徐注入含有 9ml 灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混合均匀，制成 1:100 的稀释 液。 1.3 另取 1ml 灭菌吸管，按上项操作顺序，制 10 倍递增稀释液，如 此每递增稀释一次即换用 1 支 10ml 吸管。 1.4 根据标准要求或对污染情况的估计，选择 2～3 个适宜稀释度，分 别在制作 10 倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取 1ml 稀 释液于灭菌平皿中，每个稀释度做 3 个平皿。 1.5 稀释液移入平皿后，将凉至 46 ℃营养琼脂培养基注入平皿约 15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营