蔗糖酶实验一.pdfVIP

第七章 综合性实验——酵母蔗糖酶的提取及其性 质研究 导言 本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对 这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。 自1860 年 Bertholet 从酒酵母 Sacchacomyces Cerevisiae 中发现蔗糖酶以来，它已被广泛 地进行了研究。蔗糖转化酶（Invertase ，简称蔗糖酶）（β–D– 呋喃果糖苷果糖水解酶） （Fructofuranoside Fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26 ）特异地催化非还原糖中的α - 呋喃果糖苷 键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解成密 二糖和果糖。 本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在 细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（External Yeast Invertase ）, 其活力占蔗糖酶活力的大 部分，是含有 50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（Internal Yeast Invertase ），含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体；两种形式的酶的氨 基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser 和 Met 。它们的分子质量也不同， 外酶约为 27 万 （或22 万，与酵母的来源有关），内酶约为 13.5 万。尽管它们在组成上有 较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶， 而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 表 7-1 两种酶的性质对照表 糖 Km Km 名 亚 最适 稳定 最适 MW 含 (底物为 (底物为棉 等电点 pI 称 基 pH pH 范围 温度 量 蔗糖) 子糖) 外 27 万 4.9 50% 双 26 mM 150 mM 5.0 3.0 ~ 7.5 60℃ 酶 (22 万) (3.5 ~ 5.5) 内 ＜ 4.5 13.5 万 双 25 mM 150 mM 6.0 ~ 9.0 酶 3% (3.5 ~ 5.5) 实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的 实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单 位数。 本实验共有五个分实验： 一、蔗糖酶的提取与部分纯化； 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶； 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定； 四、蔗糖酶的纯度鉴定及其亚基分子量的测定（SDS–PAGE ）； 五、蔗糖酶的酶学动力学性质分析系列实验： （一）反应时间对产物形成的影响； （二）pH 对酶活性的影响和最适 pH 的测定； （三）温度对酶活性影响和反应活化能的测定； （四）底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数Km 和最大反应速度 Vmax 的测定； （五）尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验； （六）棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验。 实验一 蔗糖酶的提取与部分纯化 一、实验目的 学习酶的纯