基因工程基本知识及基本技术.ppt

教学要求 乳糖代谢基因表达调控图解（有乳糖时） 信息流 新陈代谢是物质与能量流动 推动物质流动的是能量 动力 物质如何流动？ 信息决定 假基因 讨论假东西 假币 假牙 有其形 无其能 进化的中间体 基因还在进化发展 作业 如何理解中心法则 基因概念 管家基因 奢侈基因 假基因 基因组 浓缩胶缓冲液（4×，pH6.80） 　 　Tris-HCl（0.50 mol/L） 6.06 g，10％（w/v）SDS 4 mL、加80 mL ddH2O溶解，用浓HCl 调pH 值为6.80，定容到100 mL，4℃存放。 电极缓冲液（pH8.30） 　Tris-Base 6.1 g、甘氨酸 28.9 g、ddH2O溶解定容至500 mL。 样品缓冲液（2×）：浓缩胶缓冲液 25 mL、SDS（固体干粉）2 g、甘油10 mL、溴酚兰20 mg、ddH2O溶解定容至50 mL，室温保存。 10％的过硫酸铵：过硫酸铵 0.10 g、ddH2O 1.00 mL、4℃密闭存放。 染色液（1000 mL）：考马斯亮兰R-250 2.5 g、甲醇454 mL、冰醋酸92 mL、水454 mL。 脱色液（1000 mL）：甲醇456 mL、冰醋酸72 mL、水472 mL。 除染液和脱色液外，均要冷冻或冷藏！ 分离胶与浓缩胶配方示例 作业 反转录 引物 作业 核酸分析技术 全自动测序仪 本章应掌握的内容 原核生物基因结构的特点。 乳糖操纵子模型。 原核生物基因组的特点。 电泳技术，PCR技术的方法、原理及应用。 DNA杂交的一般程序。 引物设计的方法与原则。 影响PCR技术的因素。 Sanger 双脱氧测序法的原理。 制备单链DNA模板 就是待测序的 DNA链。 ① 不能有5’?3’和3’?5’的外切酶活性； ② 与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。 特殊的DNA多聚酶 　dNTP / ddNTP = 3/1时， DNA电泳带谱的分离效果最好，可读出200多个核苷酸序列。 制备2’和3’双脱氧的ddNTP 2） 技术要点 需带有放射性或荧光标记。 制备一小段单链引物（DNA或RNA） 或将ddNTP带上标记 3） Sanger双脱氧终止法测序过程 　但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。 ② 模板的量： 不能太多，100?l反应体系中100ng足够。 ① 纯度： PCR对模板DNA的纯度要求不高。 4. 模板（template） 　dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。 　一般反应体系中dNTP混合液终浓度用0.2mmol/L。 　浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率。 5. dNTPs Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。 　所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。 　一般用1.5 mmol/L～4.5 mmol/L的MgCl2终浓度。 6. Mg2+的浓度 　借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。 1）荧光实时定量PCR Real—time? PCR（或TaqMan? PCR ） Ct值：样品到达域值水平所经历的循环数。 1.2.3.6 PCR技术的扩展 扩增两个引物外侧的未知序列 把线性DNA模板转变成环形分子。 template template 3’ 5’ 5’ 3’ （传统PCR只扩增两个引物之间的已知序列）。 技术关键： 2）反向PCR 使引物的外侧序列 “转变” 成内侧序列。 Temin H. 发现反转录酶， 　1975诺贝尔奖 技术关键： 利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。 3）反转录PCR（RT-PCR） 提取基因组 total RNA 反转录合成总cDNA作模板 PCR扩增 根据目的基因序列设计引物 原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。 适合扩增真核生物基因。 目的基因 的引物1 反转录成目的基因cDNA第一链 目的基因 的引物2 目的 基因cDNA第二链 PCR mRNA 1）扩增某一段DNA 从基因组中扩增； 从载体上扩增； 组织样本原位扩增； 微量残留DNA扩增； 分析模板序列； 1.2.3.7 PCR技术的应用 　在基因的某处引入核苷酸突变（缺失、