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CIRISPR 背景介绍及其操作流程 一、 CIRISPR 背景介绍 CRISPR/Cas 系统全称为常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关 联蛋白系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins)。这一系统是源于细菌中的一种 后天免疫系统 （图1）。该系统可以把侵入细菌的噬菌体遗传物质整合到自身基 因组一个或者多个CRISPR 位点作为永久的“记忆”，当细菌被再次入侵的时候， CRISPR 位点被转录生成CRISPR RNAs （crRNAs)。crRNA 随后会引导DNA 剪切酶Cas9根据序列互补的原则剪切入侵的外源核酸序列，消灭外来遗传物质， 发挥保护功能 （图2）。简而言之，源于CRISPR/Cas 系统的基因组编辑技术被 工程化为一段介导定位作用的RNA 序列 （guide RNA 和crRNA 合二为一的杂 合RNA 序列，称为sgRNA）加上一个DNA 水解酶Cas9组成的二元系统。 图1 CRISPR/Cas 系统来源于细菌的 “免疫系统”。 汉恒生物科技(上海)有限公司 1 400-092-0065 地址：上海市张江高科技园区蔡伦路150 号1 号楼 021 市场部邮箱：service@ 图2 细菌利用CRISPR/Cas 系统攻击噬菌体入侵示意图。 研究者把这一系统工程化成可以用于编辑哺乳动物细胞的CRISPR/Cas9 系统。具体包括适于哺乳动物表达的Cas9基因和定位作用的sgRNA （图3）。 方便起见，研究者把这两者放在了一个载体之中 （all in one plasmid）。 如果计划利用这一系统编辑某个目的基因，我们唯一要做的就是定制一条有效的 sgRNA。 图3 工程化的CRISPR/Cas 系统。该系统是个二元系统：负责切割的Cas9核酸酶和定位 用的 （ ）。 guide RNA sgRNA 这一革命性的基因编辑技术极其强大，可以在一般的分子实验室进行基因的敲除（KO）、 汉恒生物科技(上海)有限公司 2 400-092-0065 地址：上海市张江高科技园区蔡伦路150 号1 号楼 021 市场部邮箱：service@ 基因组片段的删除、碱基位点矫正、大片段的敲入 （KI）等操作。 二、 CIRISPR 操作流程 1、 建立基因敲除细胞系流程 1.1 确定基因名称及其物种，选择好合适的细胞系，优先选择较容易建系的细胞系； 1.2 设计定制gRNA; 1.3 构建可表达 sgRNA 和 Cas9 载体，可以构建瞬转和各种病毒版本的载体； 1.4 gRNA 表达载体切割活性检测； 1.5 构建KO 细胞系 2、 基因组片段删除流程 1.1 确定要删除的片段，选择好合适的细胞系，优先选择较容易建系的细胞系； 1.2 针对删除片段两段合适的位置各设计定制一条gRNA; 1.3 构建可表达 sgRNA 和 Cas9 载体，可以构建瞬转和各种病毒版本的载体； 1.4 gRNA 表达载体切割活性检测； 1.5 构建片段删除细胞系。 3、碱基位点矫正流程 1.1选择好合适的细胞系，优先选择较容易建系的细胞系； 1.2 在需要矫正碱基位点或其附近设计定制gRNA; 1.3 设计合成Donor 模板； 1.4 构建可表达 sgRNA 和 Cas9 载体，可以构建瞬转和各种病毒版本的载体； 1.5 gRNA 表达载体切割活性检测； 1.6 构建点矫正的细胞系。 4、大片段敲入流程 1.1选择好合适的细胞系，优先选择较容易建系的细胞系；