第6章基因的转移与重组体的检测4.ppt

第一项免疫筛选技术发展于上世纪70年代晚期。最早使用质粒载体进行表达筛选。 八十年代中期改用噬菌体载体进行表达筛选。 As long as the expressed protein is functional and that function can be exploited to screen an expression library, the corresponding clone can be identified. 制备探针注意问题： 核苷酸探针长度17～20个核苷酸； 合成一组混合的探针； 根据密码子的使用频率，合成猜测体探针。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。 要注意cDNA片段在表达载体中的方向和阅读框问题 互补分析只有在有合适的突变表达宿主存在时才能使用，但在很多情况下，目的基因的功能对一项技术来说太独特了，无法在细菌和酵母表达宿主中进行研究；而且，即使是在高等的真核生物表达体系中，宿主功能的缺失也可能可以由一个或多个其他的基因来全部或者部分地弥补。因此，后来又发展了另一种方式来筛选，即利用使宿主细胞获得功能来鉴定克隆。 * 表型克隆：如差异筛选法、差减杂交（SH）、mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、代表性差异分析（RAD）、抑制型差减杂交（SSH）等 基因文库构建后，若目的序列未知，无法提供探针进行筛选，则可以考虑采用差别杂交法筛选目的基因（前提是目的基因是时空特异性表达的）。 早期进行差异克隆的方法都是差异筛选。主要用于鉴定中等丰富的差异表达cDNA。 适合鉴定中等丰度的mRNA 一些菌落对两种探针都显示出阳性信号，表明这是在这两个发育阶段都存在的很丰富的mRNA类型的cDNA。 一些菌落对两种探针都没有阳性信号，表明在这两种组织中都无法检测出想到那个含量的mRNA。 另有一些菌落对原肠胚探针有阳性克隆，而对卵探针则没有。这可以直观地从视觉上判断出来，说明这是差异表达的克隆。 局限性： 灵敏度比较低，不适于低丰度mRNA目的基因分离；需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑；差别杂交重复性较差；不同滤膜间DNA保有量不均一；杂交信号强度不一致；重新点杂交 真核生物在生长发育过程中不同组织或同一组织的不同发育阶段，由于基因特异性的表达，其mRNA表现不同，这样从表达特异基因的组织中提取 mRNA，反转录为cDNA，从无特异基因表达的组织中提取mRNA，两者杂交，在表达特异基因的组织和无特异基因表达的组织中均表达的基因产物形成杂交分子，而特异mRNA转录的cDNA仍保持单链状态，把这种单链cDNA分离出来即为差异表达的基因。 又称差减杂交、扣除杂交、减数杂交、消减杂交、减法杂交。 链霉抗生物素蛋白是由链霉菌Streptomyces avidinii中提取的分子量60000的蛋白质，能和aridin(亲和素，抗生物素蛋白)一样与生物素(biotin)专一地结合。 这两种技术的差别在于它们用于合成cDNA第一链的引物不同。前者（DD-PCR）的反义引物是一段带有特异性二碱基延伸的寡聚T引物，可结合到mRNA的3’末端；后者的反义引物是简并的，原则上可以在序列的任何位置退火。每一次操作，还要使用一条简并的正义引物，从而可以从mRNA分子集群中扩增出部分cDNA；电泳后割下差异表达的cDNA凝胶定性以验证其差异表达。 这一方案的依据是在高等真核生物中所有的生命过程和病理变化，不论是由单基因控制的还是由多基因控制的，最终都是通过基因表达的质或量的差异而体现出来。研究基因表达差异,研究两基因组差异表达基因的分离，为克隆复杂性状相关基因开辟了重要的途径。该方案可以检测、分离出全长任何部分有突变的mRNA。 得到20 000条左右的DNA条带，每一条都代表了一种特定的mRNA 覆盖了一定发育阶段某种类型细胞中所表达的全部mRNA种类的96％左右 目前较为流行的方法是对mRNA进行3种归类，即用3种3 ’端锚定引物和80种5’端随机引物组成的240组引物进行PCR扩增 PCR反应中加入放射性核素35S或者32P以便标记反应产物。有一对引物的PCR产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，放射性自显影后发现，可显示60-160个条带。不同样品间进行比较，可显示出差异表达条带。将此条带割胶回收，利用该片段标记后做探针，进行cDNA文库或基因组文库的筛选，以分离该差异片段对应的全长cDNA或完整基因。 实际上这些显示技术有个很严重的问题就是，它们会产