重组融合蛋白egf-e4orf4多聚体的鉴定及结构分析.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（７）：１７ 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 檪 研究报告 殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪殏 重组融合蛋白ＥＧＦＥ４ｏｒｆ４多聚体的鉴定 及结构分析  倪蓓蓓　范真真　陈　虹 　黄秉仁 （中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室　北京　１００００５） 摘要　目的：确认重组融合蛋白ＥＧＦＥ４ｏｒｆ４为多聚体及其具有ＥＧＦＲ结合活性。方法：通过凝胶 过滤层析、ＳＤＳＰＡＧＥ和免疫印迹分析重组融合蛋白ＥＧＦＥ４ｏｒｆ４是否形成聚合物。利用动态光散 射、静态光散射和圆二色谱测定ＥＧＦＥ４ｏｒｆ４的分子半径、分子量和二级结构。应用流式细胞术分 析ＥＧＦＥ４ｏｒｆ４与细胞表面ＥＧＦＲ结合能力。结果：凝胶过滤等方法证实ＥＧＦＥ４ｏｒｆ４形成了多聚 ７ 体，光散射实验证明了ＥＧＦＥ４ｏｒｆ４多聚体的分子量和分子半径分别为１．６５６×１０Ｄａ、６７．９０ｎｍ， 约为８２０聚体。圆二色谱表明该聚合体融合蛋白含有大量的 折叠结构。受体结合实验证明该 β 聚合物具有ＥＧＦＲ结合活性。结论：重组融合蛋白ＥＧＦＥ４ｏｒｆ４以蛋白多聚体形式存在，可以与 ＥＧＦＲ结合。因此，ＥＧＦＥ４ｏｒｆ４作为一种新型靶向性抗肿瘤药物，具有潜在的临床应用前景。 关键词　ＥＧＦＥ４ｏｒｆ４　多聚体　光散射　圆二色谱　生物学活性 中图分类号　Ｑ７８ 　　 表皮生长 因子受体 （ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ 物、细胞毒素、酶等，而靶向性载体主要包括 ＥＧＦＲ的 ［３］ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＥＧＦＲ）在许多肿瘤尤其是实体肿瘤细胞中高 单克隆抗体和其配体 。 ［１］ 　　腺病毒早期转录区４第４编码蛋白（ｅａｒｌｙｒｅｇｉｏｎ４ 表达 ，它与细胞的增殖、肿瘤侵袭、转移以及细胞凋 ［２］ ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ４ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｅ４ｏｒｆ４）是腺病毒早期基因 亡的抑制相关 ，因此 ＥＧＦＲ成为肿瘤治疗的重要靶 点。目前靶向ＥＧＦＲ治疗肿瘤的方法包括：１、ＥＧＦＲ酪 的产物，是由１１４个氨基酸组成的１４ｋＤａ的小分子蛋 氨酸激酶抑制剂治疗：利用小分子化合物抑制 ＥＧＦＲ 白，它可以选择性地杀死肿瘤细胞、转化细胞，可诱发 肿瘤细胞发生不依赖 ［４５］ 胞内区酪氨酸激酶磷酸化，主要代表药物为吉非替尼 ｐ５３基因的凋亡 ，而对正常细 （Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）和埃罗替尼（Ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）；２、ＥＧＦＲ单克隆抗 胞无毒副作用。 体治疗：如 目前 已经上市的药物有西妥昔单抗 　　本实验室在前期工作中，利用表皮生长因子 （Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）和帕尼单抗（Ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）；３、基因沉默 （ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＥＧＦ）对 ＥＧＦＲ的特异结合性 治疗，如ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ，干扰小ＲＮＡ）的 及具有选择性杀伤作用的腺病毒毒性蛋白Ｅ４ｏｒｆ４，构建 应用等；４、生物“导弹”治疗：以细胞毒等作为“弹头”， 了毕赤酵母表达载体，表达出重组融合蛋白 ＥＧＦ 依靠靶向性载体对肿瘤细胞的特异性亲和力，将“弹 Ｅ４ｏｒｆ４，为候选的靶向抗肿瘤药物。前期细胞学实验显 头”物质