实验二重组dna的提取及酶切鉴定.pdf

实验二 重组DNA的 提取及酶切鉴定 复旦大学上海医学院医学实验教学中心 王松梅 021 smwang2@fudan.edu.cn 1 一、实验目的 掌握以下方法和技术： 1. 质粒DNA的小量快速制备 2. 质粒DNA的限制性内切酶酶切 3. DNA的琼脂糖凝胶电泳 2 二、实验原理 1. 质粒DNA的小量快速制备 分离质粒DNA有三个步骤： 1）培养细菌使质粒扩增 2）收集和裂解细菌（本实验：SDS裂解） 3）分离和纯化质粒DNA （本实验：碱变性法） 3 碱变性法抽提质粒DNA Solution II Solution III 离心后去向 pH12.6 pH4.8 氢键断裂，双螺 染色体DNA 不能完全复性 沉淀中 旋解开 氢键部分断裂， 质粒DNA cccDNA互补链 复性 上清中 不完全分离 4 质粒的纯化方法 层析法：常用 离心法：经典，纯度高 电泳法 沉淀法：大量 硅基质材料(树脂）纯化质粒DNA DNA分子中的磷酸二酯键骨架在盐溶液的作用下脱水，使 得暴露的磷酸基团吸附硅胶。双链DNA分子一旦被硅胶吸 附，一般的洗液不能将其洗脱下来，只有水溶性的缓冲液， 如TE或水重新水化后，DNA才能从层析柱上定量回收。 6 2. 质粒DNA的限制性内切酶酶切 c-myc基因片段4.8 kb BamH I + Xba I双酶切（酶切完全时） 琼脂糖凝胶电泳凝胶中2条区带 pSV-c-myc 8.3kb 3.5kb pSV2载体片段 BamH I 4.8kb c-myc 目的基因片段 Xba I pSV2载体片段 3.5kb 7 3. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖——海藻中提取的线状高聚物 加热融化成清澈、透明的溶液 凝固后成凝胶