一株产凝集素的三叶半夏内生真菌的研究 - 生物通.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（６）：６３～６７ 一株产凝集素的三叶半夏内生真菌的研究 １ １，２ ２ １ 张晓含 　竺锡武 　谭济才 　陈集双 （１浙江理工大学生物工程研究所　杭州　３１００１８　２湖南农业大学　长沙　４１０１２８） 摘要　研究三叶半夏内生真菌及其凝集素，旨在为半夏内生真菌及其凝集素的开发利用提供依 据。对三叶半夏块茎内生真菌分离、纯化，液体发酵培养代谢产物，无水乙醇提取总蛋白，兔血红 细胞检测其凝集活性，筛选出菌株 ｇｓ１，其总蛋白对兔血红细胞凝集活性显著。使用甘露聚糖? Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析柱纯化菌株ｇｓ１总蛋白，得到凝集素。Ｂｒａｎｄｆｏｒｄ法定量检测分析表明，１０００ ｍｌｇｓ１发酵培养液中含有９．５８ｍｇ凝集素。ＳＤＳＰＡＧＥ电泳分析显示该凝集素为单一条带，分子 ? 量约为１２ｋＤａ。凝集活性实验表明，该凝集素对兔、大鼠和小鼠的血红细胞具有凝集作用，对兔 血红细胞效果最显著；而对人（Ａ＼Ｂ＼Ｏ＼ＡＢ型）和鸡的血红细胞无凝集作用。糖结合活性实验表 明，甘露糖对该凝集素的凝集活性具有抑制作用。通过初步分类鉴定，菌株ｇｓ１为半知菌亚门，丝 孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，曲霉属。 关键词　三叶半夏　内生真菌　凝集素 中图分类号　Ｑ８１９ 　　内生菌是指一类在其部分或全部生活史中存活于 性和其他一些性质进行了研究。该凝集素与甘露糖专 健康植物组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染 一性结合，具有抗肿瘤、抗早孕等生物活性。由于野生 ［１，２］ ［３］ 半夏生长缓慢，加上过度采集，灾害性气候的影响等多 症状的微生物 。１９９３年，Ｓｔｉｅｒｌｅ等 首次从短叶红 豆杉中分离得到一株能合成抗癌物质紫杉醇的内生真 方面的因素，导致半夏供不应求。作为一种需求量较 菌，表明药用植物内生真菌可以合成和宿主植物相同 大的传统药用植物，目前对半夏的研究主要集中在人 或相似的活性成分。这一发现为利用植物内生菌进行 工栽培、组织培养和细胞培养等方面，尚无半夏内生菌 工业化发酵生产某些重要天然药物，缓解某些药用植 以及其代谢产物生物活性方面的研究报道。本研究通 物的濒危状况提供了新的思路。至今，我国已经研究 过实验筛选出产凝集素的半夏内生真菌菌株，并通过 了 ［４，５］ 对产物的分离和亲和层析纯化得到凝集素纯品，从而 ２１科４４属６２种２变种植物的内生真菌 ，其中张 ［６～８］ 为半夏内生菌的研究和应用提供了一定的依据。 玲琪，邵华等 对抗癌药用植物内生真菌进行了广泛 的研究，并分离得到了抗癌活性化合物。 １　材料与方法 　　三叶半夏Ｐｉｎｅｌｌｉａｔｅｒｎａｔａ（Ｔｈｕｎｂ．）Ｂｒｅｉｔ．为天南星 科半夏属多年生草本植物，其块茎是一种重要的中药 １．１　材料与试剂 材［９，１０］，含有多种生物活性物质。半夏蛋白为其有效成 　　三叶半夏块茎分别采自于浙江、四川、甘肃、山西、 ［１１］ 山东等省；采血用新西兰大耳兔、家鸡、大鼠、小鼠分别 分之一。陶宗晋等 首次从半夏块茎鲜汁中分离出半 夏蛋白，后证明是一种凝集素，之后陶宗晋、孙光星、朱 来自浙江理工大学和浙江中医药大学动物房。人血（Ａ 铭伟、王克夷等［１１～１４］分别对半夏凝集素的结构、生物活 ＼Ｂ＼ＡＢ＼Ｏ型）采自浙江大学医学院附属儿童医院。 　　甘露聚糖和溴化氰活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ（