hplc high performance liquid chromatography 高效能液相层析法.ppt

高效能液相層析儀HPLC High Performance Liquid Chromatography HPLC原理 HPLC分析是利用動相通過靜相時，混合物中的各成份在靜相和動相之間的分布係數不相同（即親和力不同），使其在管柱中的滯留時間不相同而分離的方法 若化合物與靜相親和力較強，則沖提較慢（即滯留時間長），而化合物與動相的親和力較強，則沖提較快（即滯留時間短），依此原理將樣品中的待測物與干擾物分離。 HPLC原理 在逆相層析法中，通常以高極性作為流動相，靜相為非極性，極性大的樣品成分會先被沖提出來，極性小的較慢沖提出來，因而達到分離效果 在正相層析法中，則是以非極性為流動相，靜相為高極性，極性小的樣品成分會先被沖提出來，極性大的較慢沖提出來，因而達到分離效果 樣品進行分離時也可以改變動相來進行梯度沖提 Column 選用較小顆粒的Packing size及較長鏈的填充物或者管柱半徑較小者以增加其分離效果 HPLC原理 HPLC適用於 1.半揮發性化合物 2.非揮發性化合物 3.樣品沸點過高 4.不宜加溫而不便使用氣相層析儀者的待測物 應用此方法進行分析的先決條件是待測物必須溶於作為動相的溶劑中 HPLC可用於 1.液相樣品的定性及定量分析 2.製備純品之用途 HPLC原理 干擾可能來自於溶劑、試劑、玻璃器皿、塑膠器皿，及其 他處理過程所接觸器具之污染。這些干擾可能會產生假峰或基線偏 高。因此，必須以試劑水進行系統空白試驗，以確定在此分析條件 下，所用的物質及器具均未受污染。 由於分析高濃度樣品再接著分析低濃度樣品時，會引起跨樣品的污染，為減低跨樣品間的污染，樣品注射針須用溶劑清洗，遇到異常濃度樣品時須注射一針空白溶劑以檢查樣品間之交叉污染之可能。 HPLC原理 加入沖提液(動相)沖提 將樣品(混合物)加入Column管柱中，隨著沖提液持續沖提，混合物內 的不同溶質會因極性不相同而逐漸分離開來，最後由偵測器偵測出訊號 靜相 Sample Packed Column 偵測器 Time HPLC原理 Detector signal Time HPLC裝置圖 Detector 溶劑儲存槽 溶劑分配閥 氣源 Pump column 樣品注射閥 壓力傳感器 逆壓調節閥 防逆流 驅動流速 過濾器 小孔徑 除去固體 利用小針筒 將氣體抽走 排放閥 使流速穩定 之長管路 動相儲存槽與溶劑處理系統 動相之選擇可先以TLC片預測 動相儲存槽通常配有除去溶解氣體(氮氣or氧氣)的配件，此溶解氣體會在管柱及偵測器中形成氣泡而干擾分析操作結果 溶劑中可能含有灰塵等顆粒性物質，會對pump造成損害及阻塞管線，故HPLC中配有過濾器 故動相在使用之前，須先進行過濾、除氣之前處理動作 Pump Pump選擇條件: 輸出壓力應可達6000Psi(408.27atm) 輸出流速應穩定 流速範圍應於0.1-10 mL/min之間 應使用抗腐蝕的組件 管柱的選擇 液－固相層析 液－液相層析 離子交換層析 離子對層析 分子篩層析 液－固相層析 液－固相層析(liquid-solid chromatography；LSC)是指當固定相為固體的液相層析，主要作用力為吸附作用(adsorption)。 其固定相顆粒大小約為5~10 μm的矽膠顆粒，而面積約為200 m2/g，在矽膠顆粒表面不規則地接上-OH基，利用這些-OH基與欲分離之化合物間之作用力不同而將不同化合物分離。 由於移動相不應與固定相有作用，因此移動相中若含有水或極性溶劑將使分離效果降低。 液－液相層析 液－液相層析(liquid-liquid chromatography；LLC)是指當固定相為液體的液相層析，主要作用力為分配作用(partition)。 這裡所指的液體固定相指附著在均勻顆粒上之的液體。 固定相液體與移動相液體不互溶，但因溶質成分會因對二種不互溶液體有分配率差異的作用，而達分離的效果。 液－液相層析所使用的溶劑一定需先脫氣(degas)，以免產生氣泡，而影響流速與分離效果。。 離子交換層析 離子交換層析(ion-exchange chromatography；IEC)是指當固定相為離子交換樹脂的液相層析管柱，作用力主要為離子交換作用。 離子交換層析管柱主要用於分離與分析離子樣品。陰離子交換層析固定相為陰離子交換樹脂，試樣應為陰離子，移動相應以鹼液沖提；陽離子交換層析固定相為陽離子交換樹脂，試樣應為陽離子，移動相應以酸液沖提。 影響離子交換層析管柱分析效果的因素有pH值、離子性質、強度、溫度、有機溶劑添加、固定相性質與鉗合作用等。 離子對層析 離子對層析(ion-pair ch