技术咨询电话：400-607-9999 胞核胞浆胞膜制备试剂盒 nucl-cyto .doc

胞核胞浆胞膜制备试剂盒 Nucl-Cyto-Mem Preparation Kit 货号：P060089 描述：从哺乳动物新鲜或冻存的组织块、贴壁或悬浮培养细胞中，制备细胞核、细胞膜与胞内质膜、细胞浆等三种主要亚细胞组分。独特的试剂成分与优化的制备方案相结合，使胞核-胞膜-胞浆制备过程简单易行，无需特殊设备和超速离心，制备过程可在1小时内完成。制备的细胞核、细胞浆组分纯度甚高，而且较少交叉污染。单一的细胞膜的纯化是一个特殊问题，本试剂盒制备的胞膜是细胞膜和细胞器如线粒体、内质网、高尔基体及其质膜的混合物。制备的细胞核是完整的未裂解的细胞核，但胞浆组分为可溶性胞浆蛋白。制备的亚细胞组分的纯度可胜任后续免疫共沉淀、SDS、2-D gel电泳、Western Blotting、酶活性测定、受体分析等。 组成：(100 extractions, 8 x 106 cells per extraction) CER, Cytosol Extraction Reagent，50 ml; MER, Membrane Extraction Reagent，5 mlNER, Nuclear Extraction Reagent，100 ml; Suspension Buffer，20 ml 储存：4 oC避光保存1年。 收集细胞：准确计数，每一制备使用等量的细胞数，将明显改善后续检测结果的一致性。每一制备约需要8 x 106 ~ 1 x 107个细胞。 贴壁细胞：PBS冲洗细胞皿，胰蛋白酶消化细胞。800 x g 离心5-10 min。弃上清，用PBS重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。注意：为避免胰蛋白酶在后续制备过程中降解蛋白质，可用无酶细胞消化液(Non-enzyme Cell Disassociation Solution)使贴壁培养的细胞与瓶皿分离。 悬浮细胞：800 x g 离心5-10 min。弃上清。用PBS重悬洗涤细胞并再次离心收集细胞。 估计细胞沉淀压积PCV (packed cell volume)：通常1 x 106 个细胞离心后的PCV约为10-20 (l，1 x 107 个细胞的PCV约为100 (l。注意PCV大小与细胞数量有关，也与细胞类型、大小、离心速度有关。 制备步骤 制备全程在4 oC或冰水浴中进行。 1.1 细胞匀浆裂解 每1 x 107个细胞或~100 (l PCV的细胞沉淀加入500 (l CER试剂，震荡重悬。冰浴2 min。将细胞悬液转移到冰预冷的玻璃匀浆器内。冰上上下手动匀浆20-30次。注意：破碎细胞是关键环节。用1-3 ml小容积玻璃匀浆器，须选用间隙严密的研杵，其特征是将研杵插入匀浆器套管后，可提起研杵而套管不会脱落。有效研磨是上下推拉研磨而不是旋转。破碎效果与细胞类型有关。可在相差显微镜下检查，未裂解细胞应少于5%。 1.2 组织块匀浆裂解 取250 mg哺乳动物新鲜或-80 oC冻存的组织块，勿剪碎为更小的块。放入冰预冷的玻璃匀浆器内。加入500 (l CER试剂。用研杵旋转将组织块捣碎，上下手动预匀浆20次。冰浴10 min。然后上下手动预匀浆7次。 注意：与培养细胞特别是贴壁细胞相比，组织块中的细胞在匀浆时较易破碎，因而并非必须选用间隙严密的研杵。如果研杵与套管过于严密，组织匀浆困难，可选用研杵与套管稍松的匀浆器。破碎效果与组织细胞类型有关。可在相差显微镜下检查，未裂解细胞应少于5%。 2. 取出~500 (l裂解混合物，转移到1.5 ml离心管。800 × g，4 oC离心5 min。粗细胞核沉淀在管底，上清为胞膜-胞浆混合物。按照以下步骤首先制备膜与胞浆，然后制备细胞核，或用两台离心机同时制备。 3. 膜与胞浆制备： 3.1. 将步骤2 获得的上清液转移到新管，估计上清液体积； 3.2. 立即加入1/10积量的MER与上清液混合。冰浴5分钟； 3.3. 最大转速14,000 rpm 4 oC离心30分钟； 3.4. 取出上清液转移到新管，此为胞浆组分； 3.5. 沉淀为胞膜组分，含细胞膜和细胞内质膜的混合物。再次瞬时离心除尽液体，用100 (l或适宜体积的Suspension Buffer或自备溶液重悬胞膜。 4. 细胞核制备： 4.1. 加入500 (l NER，振荡重悬步骤2 获得的粗核。必要时按步骤1.1匀浆胞核； 4.2. 4000 × g，4 oC离心5 min。弃上清； 4.3. 再次加入500 (l NER洗涤胞核沉淀，并重复步骤4.2，离心后的上清应清亮； 4.4. 弃上清除尽液体。用100 (l或适宜体积Suspension Buffer或自备溶液重悬细胞核。 说明 制备的胞浆组分或重悬于Suspension Buffe的胞膜胞核组分可进行Bradfor