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对烟草花粉管通道技术导入外源DNA的思考 　　摘要　本文综述了花粉管通道技术的创立、发展与现在的应用情况，比较了该方法与其他转化方法的优势及局限性。通过对比多种开花作物的导入时期和方法，对在烟草中应用该项技术提出了自己的想法。 　　关键词：花粉管通道技术、烟草、外源DNA导入 　　什么是花粉管通道技术？ 　　花粉管通道技术（pollen　tube　pathway）是Zhou［1］等人提出，DNA片段杂交理论之后设计的自花授粉后外源DNA导入植物的转基因技术。花粉管通道技术，又称授粉后外源基因导入植物技术，是指利用植物授粉后所形成的天然花粉管通道（花粉引导组织）经珠心通道将外源DNA携带进入胚囊，转化受精卵或其前后的生殖细胞（精子、卵子），由于它们仍处于未形成细胞壁的类似“原生质体”状态，并且正在进行活跃的DNA复制、分离和重组，所以很容易将外源DNA片段整合到受体基因组中，以达到遗传转化的目的。关于该项技术的原理，Potrykus（1990）对受精过程的研究认为，在受体组织中，同时具备再生感受态和转化感受态的细胞是转化成功的关键。当受精过程开始后［2，3］，卵细胞发生急剧的脱分化过程，形成合子后，彻底消除了以前的分化特性，变成核大、质浓和分裂活跃的细胞，具有再生及转化感受态细胞的特点。亚显微结构的观察揭示，在精子进入时，卵细胞的细胞壁还未形成，一些壁物质分散地聚集在细胞膜的表面，似小岛状［4，5］。因此这些卵细胞类似未完全酶解的原生质体，为外源基因的进入提供了可能性。 　　该技术的提出是基于Hess（1980）［6］的试验，他报道了花粉粒可以吸收外源DNA的结果。我国学者在远源杂交的基础上，通过授粉时混入异源花粉匀浆的方法，在后代中发现了对应性状的变异，从而推测可能有异源DNA参与了受精过程。1983年，中科院上海植生所周光宇教授，成功地将外源海岛棉DNA导入陆地棉，培育出抗枯萎病的栽培品种，创立了花粉管通道技术［7］。但这些结果都得不到分子水平上的验证和明确的基因表达产物，使这一方法无法应用到转基因植物中。Luo（1988）［8］等人首次报道了用花粉管通道技术将含报告基因的质粒DNA转入水稻，经southern杂交和酶学测定证明，得到了外源基因整合并表达的转基因水稻植株。使花粉管通道技术的转化工作能够像其它直接转化法一样，完全按转基因技术的操作进行。随后，谢道昕（1991）［9］将2个Bt杀虫基因导入棉花品种中，后代经分子杂交证明杀虫基因已整合到棉花基因组中，同时报告基因（GUS）也得到表达。康耐尔大学的呈瑞博士等（1988）利用花粉管通道技术，从事水稻基因转育，转化植株经southern杂交证明，获得了理想的转化结果。台湾缪芳心等（1995）［10］利用花粉管通道技术，建立了甘蓝基因转育系统并通过外源总DNA的导入，将抗白粉病性状导入甘蓝受体（1998）。阎新甫等（1994）［11］将抗白粉病大麦DNA通过花粉管途径直接导入感病的小麦品种“花76”中，他们不仅获得了符合遗传规律的稳定抗病后代，而且还确定了抗白粉病是由一对显性基因控制。曾君祉（1993）［12］利用花粉管通道技术将报告基因、目的基因等转入小麦，经Southern-blotting、Northern-blotting等方法鉴定和对表达产物进行检测，及对小麦转基因植株后代连续4代遗传表现的观察，证明转入的外源基因可以稳定遗传，转化率为4.7%，遗传规律与其它转化方法，如农杆菌介导法、基因枪法等的结果相似。丁群星等（1993）［13］用子房注射将Bt基因导入玉米自交系，获得转基因玉米（TO），经点杂交、southern杂交及PCR扩增，均获阳性结果；D1代中有7株的PCR扩增呈阳性结果。易地重复该试验，也获得了成功。说明该方法是可以重复的。至此，花粉管通道技术已在多种作物中获得成功，确立了其在直接转化法中的地位。 　　由此可以证明，花粉管通道技术可以用于基因表达载体和总DNA等多种形态的遗传物质的转化。与载体转化系统和种质转化系统等外源基因转化法相比，花粉管通道技术有其独特的优势与应用。对该技术的评价： 　　（一）优点： 　　1.此法可以应用于任何单胚珠、多胚珠的单子叶、双子叶显花植物，只需了解其开花习性、花器构造及授粉受精过程，试验出注射外源DNA的最佳时间，即可应用。操作简便，成本低，适合普及应用。 　　2.受体、供体来源范围广。 　　3.此法得到的种子，可以直接应用于常规育种，不需经过细胞或原生质体培养、诱导再生植株等费时费力的过程。 　　4.缩短育种年限。只有部分外源DNA片断进入受体基因组，避免了供体基因和受体基因组得全面重组，因而易于稳定。此法可以任意选用生产上的优良品种，进行目的性状基因转化，同时仍保持受体的优良性状。只有部分外源DNA片段进入受体基