细胞化学和组织化学.pptVIP

组织化学技术 ;序 言;组织化学（histochemistry）/细胞化学(cytochemistry)是运用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术，对组织与细胞的化学成分、化学反应及其变化规律进行定性、定位和定量研究的科学。 主要研究对象是生物大分子(如核酸、蛋白质、酶、多糖和脂类等)在细胞内的结构和功能活动中的分布与变化以及亚细胞组分和细胞器在整个生命活动中的作用等。;一、组织化学发展简史 ;(1890一1920)随着显微镜的改进和组织细胞学染色技术的发展，组织细胞化学开始从生理组织学的概念转为显微化学。 依赖细胞内的某些酶催化特异底物的化学反应形成酶细胞化学。 70年代由于细胞显微分光光度法和荧光显微光度法的建立，使细胞化学的成分得以定量，形成了定量细胞化学。; 80年代电镜细胞化学可以观察化学成分的亚细胞定位。 80 ～ 90年代，先后流式细胞术、激光扫描共聚焦显微技术出现。;激光扫描共聚焦显微技术，相似于对单个细胞进行细胞“CT”分析，并能研究活细胞和定量分析细胞内的遗传物质DNA、RNA、细胞器的酶含量，细胞内各种荧光标记物(包括分子和离子的浓度及其分布，如Ca2+和pH值等)，;二、组织化学技术的基本要求 ;3．反应物须有显色性和定量的可能性，即必须是有色的沉淀或结晶，沉淀颗粒细小连续、色深、不溶，并能保留在原位上。颜色深度要与物质含量或酶的活性具有一定的比例关系。 4．反应物要有稳定性和重复性，以利于观察研究和验证。 5．反应物有灵敏性和特异性，以利于对比观察。 6．反应产物有对照，否则难以判断其结果的可靠性。;三、细胞化学技术显示的化学成分：;四、细胞化学染色的原理：;一）金属-金属盐沉淀反应原理;二）偶氮偶联法原理;三）过碘酸Schiff氏剂反应法原理;四）联苯胺法原理;五）色素形成法原理;六）底物标记法原理;七）荧光染色与免疫荧光法原理; ;一、组织取材注意事项;4.取材时间 原则上，应尽快取材，但较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材，脑组织和神经组织应采用灌注预固定后，再进行后固定。 5.注意包埋方向，包埋时要平整。 6.保持材料的清洁 7.切除不需要的部分，骨组织需脱钙 8.明确编号，登记; 培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞处理方法有： （1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在包被有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。（2）将细胞直接培养在盖玻片上。（3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，固定后备用。  胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本，可用离心沉淀法收集细胞。 ;三、组织标本的固定;（3）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构，固定剂兼有硬化作用 （4）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。 ;2.固定液的种类;(2) 4％多聚甲醛固定液 (3) Bouin’s液 苦味酸饱和水溶液 75ml 甲醛 25ml 冰醋酸 5ml 渗透速度快，收缩小，组织固定均匀，保持结构完整，适合于各种胚胎连续切片，对于肝、皮、胰腺特殊染色效果好。固定为12～24小时，但固定过久，对碱性染料着色不利。;（4）Carnoy氏液 纯酒精 60ml 氯仿 30ml 冰醋酸 10ml 此???定液渗透速度快，2mm以下小块组织固定时间2～4小时，它是细胞核极好的固定液，适合于细胞分裂、RNA、DNA及糖元等固定。固定后直接入纯酒精脱水。 ;(4) PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。 (5) Methacarn固定液：甲醇60ml，氯仿30ml，醋酸10ml，混均后4℃保存备用，对核内抗原的保存效果较好。 (6) 丙酮及醇类固定剂：丙酮、乙醇类固定剂其固定原理主要是使蛋白质沉淀而发生固定作用。酒精是一种还原剂，用于组织固定以95%的浓度为宜，酒精固定后的组织细胞核着色不良，一般用于糖元的固定。甲醇、丙酮常用于细胞固定。;固定时间要视组织块的厚薄、固定液的种类及浓度、温度而定。原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。 组织固定后必须彻底冲洗。;绣镁被沾怜帅产屈聪慰腥惟姥臻酮牛舰驳苛渗掉泽向断抖贴誉撑酌砸桨美细胞化学和组织化学细胞化学和组织化学