药学分子生物学（唐晓波）第十章 外源基因表2.pptVIP

复习 药物蛋白质组学及应用 药物筛选模型 *药物筛选模型是用来确证某种物质是否具有生物活性和治疗作用（及药理活性）的一种实验方法。 *新药筛选模型 整体动物模型 组织、器官水平模型 分子水平模型 1.药物靶点 *Drug target(药物靶点)：是细胞内与药物相互作用，并赋予药物效应的分子。 作为药靶的必要条件： 疾病成分中高表达 体外实验：可控 动物实验：再现 人体试验：有效 *蛋白质组学发现药靶的基本策略 比较正常与疾病： 组织 细胞 或体液 的蛋白质表达谱差异和表达量变化。 *基因工程药物： 将生物体内生理活性物质的基因，利用重组DNA技术加以改造，然后使其在细菌、酵母、动物细胞中大量表达的新型药物。 一、名词解释（本题共10道题，每题2分，共20分） 二、填空题（本题共30个空，每空1分，共30分） 三、单项选择题（本题共20道小题，每题1分，共20分） 四、多项选择题（本题共10道小题，每题1分，共10分） 五、简答题（本题共2道小题，每题5分，共10分） 六、论述题（本题10分） 第二节 外源基因表达基本过程 主要内容 一、目的基因的获得 二、目的基因与表达载体的重组 三、重组表达载体导入宿主细胞及其筛选与确认 一、*目的基因的获得 基因组DNA文库 cDNA文库 PCR法 化学合成法 1.基因组DNA文库 定义：组织细胞的全部DNA提纯，酶切，酶切片段均重组入同一类载体，得许多重组DNA分子，全部转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝，这样生长的全部细菌所携带的所有基因组DNA片段，即为整个基因组。 3.PCR PCR是一种模拟天然DNA复制的体外扩增DNA序列的技术，用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。 4.人工合成 应用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 二、目的基因与表达载体的重组 （一）载体 （二）重组 （一）载体 *基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源DNA而将目的DNA带入宿主细胞。 载体的分类 （一）克隆载体 （二）表达载体 （三）穿梭载体 （二）重组 *是指在体外用酶学方法将不同来源的DNA进行切割、连接，组成一个新的DNA分子的过程，又称DNA重组。 重组 1.DNA限制性内切酶 2.DNA连接酶(DNA ligase) 3.基因与载体重组及其策略 第一个字母，大写，取自它来源细菌属名的第一个字母；第二、三个字母，小写，取自它来源细菌种名的头2个字母；第四个字母取自它来源细菌株系；最后用罗马数字大写，代表同一菌株中不同限制酶的编号。前3个字母斜体 DNA限制性内切酶的特性 只切双链 识别特定序列 需要Mg2+ 2.DNA连接酶(DNA ligase) 催化双链DNA中一条链的3ˊ－OH与另一条链的5ˊ－PO3H2形成磷酸二酯键，使具有相同粘性末端或平末端的DNA末端连接起来。 3.基因与载体重组及其策略 Gene recombination 解决自连：碱性磷酸酶 方向性：双酶切 三、重组表达载体导入宿主细胞及其筛选与确认 （一）宿主细胞（Host cell） （二）*重组子导入宿主细胞 （三）宿主细胞内重组子的筛选与确认 （一）宿主细胞（Host cell） 原核：大肠杆菌、枯草杆菌 真核：酵母、昆虫、植物、哺乳动物细胞 对宿主细胞的要求 限制酶和重组酶缺陷 与载体之间具有互补功能 受体细胞处于感受态 遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长 对宿主细胞的要求 安全宿主细胞 内原蛋白水解酶缺失 具有较好翻译后加工机制 （二）重组子导入宿主细胞 1.转化 2.转导 3.转染 1.转化（transformation）： 是指感受态细胞接纳外源DNA分子的过程，并使其在宿主细胞内实现复制、扩增、转录与翻译。 短的多肽可以携带质粒DNA、siRNA，多肽，蛋白或各种核酸进入细胞 细胞穿透短肽(cell-penetrating peptides, CPPs)的优势在于入胞速度快，转导效率高，生理状态下稳定、无毒、无免疫性等。 CPPs是一类以非受体依赖方式，非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽，通常带正电荷。  （三）宿主细胞内重组子的筛选与确认 什么是重组体？ 为什么要对重组体进行筛选、鉴定与分析？ 如何对重组体进行鉴定与分析？ 小结 第二节 外源基因表达基本过程 *目的基因的获得 基因组DNA文库 cDNA文库 PCR法 化学合成法：偏爱性、兼并性。 *载体 基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源DNA而将目的DNA