真核生物基因组DNA的提取电泳.ppt

* * * * * * * 置50°C水浴50分钟讲解： 能溶解入10％一l5％的水分，因溶解的水分而损失部分DNA (酚不能抑制RNAase的活性, 溶解掉部分ploy(A)RNA) * * * * * * 要。 * * 本次实验使用未经酶切的DNA样品电泳，由于片段大，在加样孔附近可看到一条很亮的DNA带。 分子生物学实验 1、 欢迎大家参加分生实验的学习！ 2、 分生实验的重要性； 3、 每组2人，做一份实验； 4、 守纪律，听老师安排，穿白衣； 5、 同学们在听课时要作好记录; 6、 上课时间、课间休息。 考试形式 实验成绩考核占总成绩40%，满分为40分。缺实验课成绩者，本课程不予通过。 随堂考试（10分）(主要考察理论课与实验课结合内容 ) 闭卷考试（15分)(实验方法及原理、实验结果及注意事项、仪器设备操作及注意事项和对失败结果的原因的分析 ) 实验设计（15分）(实验名称、实验目的、方法和步骤预期实验结果、关键问题讨论及参考文献) 实验课安排 实验一 基因组DNA的提取 实验二 PCR及琼脂糖凝胶电泳检测 实验三 PCR产物的限制性酶切片段分析 实验四 总RNA的提取及逆转录 实验五 PCR产物的TA连接 实验六 转化 实验七 质粒的提取、酶切鉴定 实验八 讨论及实验课考试 实验课安排 1. 提取基因组DNA 重组质粒 6.连接产物转化 无质粒的E.Coli 死亡 有质粒的E.Coli 存活 2. PCR获取目的基因 7. 重组质粒提取及酶切鉴定 质粒 5. TA 连接 4. RNA提取与逆转录 T载体 平板筛选 ?一、加样器的使用及注意事项 1、 用途 2、 使用 2.1 根据取样量，选择合适的加样器。 5ul、50ul、500ul，应选择哪个加样器? 顶部标有加样器的最大量程， 分别为： 20ul: 0.5 ~ 20 ?l 100/200ul: 20 ~ 100/200 ?l 1000ul: 200ul ~ 1000 ?l 实验仪器的使用及注意事项 练习：加样器读数为 100，实际体积各为多少? 2.2 如何调节？ (1)首先观察目前读数,假设为050: 1000 ?l: 500 ?l 100 ?l: 50 ?l 20 ?l： 5 ?l (2)顺时针调节--- 读数变小 逆时针调节--- 读数变大 (3)注意：调节前加样器读数正处于最大量程或最小量程时，如果向错误方向调节，马上会超出量程，将会损害加样器的精度。 2.3 加样器使用步骤(示教及学生练习)： 6）(吸头内有液体时，不能将加样器倒置或平放，以防液体倒流损坏加样器！) 贴容器内壁，将液体匀速打出，加样器推到第二挡。观察吸头内液体是否完全打出并立即弃于废物盒内. 5）抬起加样器,估计体积是否正确,将外壁液体用容器口引流回去 4）缓慢松开拇指,吸取液体。松开过快，液体上冲会腐蚀加样器;完全放开拇指后，停留约半秒钟, 急于离开液面，容易吸入空气。 3）将吸头插入液面下适当深度，过深可能会腐蚀加样器, 过浅可能会吸入空气。 2）吸取液体前，先打到第一挡。 1）选择加样器,观察读数,调节读数，吸头的安装要紧密。不要用手直接拿吸头，安上吸头后一定要再固定一下 1、打开电源 2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。 二、离心机的使用注意事项 1代表转速盘上方的数据，2代表下方的数据。 3、样品配平, 对称放入离心机(管的连接处朝外). 4、设定离心时间(如设定2分钟，可定时多点时间，再用手表记时)。 5、统一离心，逐渐升到要求转速。 实验一、真核生物基因组DNA的提取和电泳 一、 实验背景 高等生物的基因组相当宠大。 真核细胞基因组约含１万个结构基因，其它大量存在的是调控序列和内含子序列。可以说某特定物种的基因组，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的 研究的起点就是要获得纯度高－不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染；得率好－以便有足够量用于分析；基因组相对完整－不断裂的基因组以便用于以后PCR分析，RFLP分析，基因文库的构建，基因探测等的研究。 掌握小鼠肝脏组织模板DNA的提取技术。 学习DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和技术。 第一部分 ：肝组织制备、蛋白酶k消化 第二部分: 酚氯仿抽提、乙醇沉淀 第三部分： DNA琼脂糖凝胶电泳 三、实验材料 小鼠肝脏组织 四、主要试剂（稍后讲解） 二、 实验目的