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小鼠四倍体胚胎凋亡及GSH和β-巯基乙醇对其影响的研究.pdf 42页

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摘要 摘 要 stemcells,ESCs)是一种高度未分化细胞,它具有发育的全 胚胎干细胞(embryonic 能性,能分化出成体动物的各种组织和器官,又称为全能干细胞。小鼠二倍体胚胎可 以经过电融合等方法产生四倍体胚胎。四倍体胚胎的着床率虽高,但是发育至妊娠中期 的胎儿往往会出现面颅部畸型,而且几乎不能发育至足月。 利用ES细胞与四倍体胚胎可以形成嵌合体,在这种嵌合体中,ES细胞能参与胚体所有 组织的生成,而四倍体胚胎主要分布在胚外组织,如胎盘、滋养层、尿囊膜、卵黄囊膜等, 几乎不参与胎儿本身的形成。因此,将ES细胞与四倍体胚胎嵌合,使二者的发育潜能互相 补偿,就可能得到完全由ES细胞发育来的个体,其胚外组织则由四倍体胚胎形成。这种技 术称为四倍体胚胎补偿技术,得到的小鼠称为ES小鼠。四倍体补偿技术在获得基因突变小 鼠,分析突变基因的表型,以及证明iPS细胞的全能性等方面有重要的作用。 早期胚胎发育过程中存在大量发育异常的细胞。细胞凋亡是清除异常细胞的重要途径之 一。着床前胚胎的凋亡现象普遍存在,但大比率的凋亡对胚胎生长是不利的。因此,人们通 过向培养基中添加某些药物来减少胚胎细胞的凋亡,进而提高胚胎的存活能力。 本实验采用电融合法制作小鼠四倍体胚胎,用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末 端标记法(TI肥L)检测了二倍体和四倍体胚胎的凋亡,并采用RT.PCR和免疫荧光染色方 法检测了凋亡相关基因的表达情况,之后,在培养液中添加GSH或p.巯基乙醇培养四倍体 胚胎,检测它们对四倍体胚胎凋亡的影响。这对于研究小鼠四倍体胚胎早期发育情况,及获 得更多的优质四倍体胚胎有重要的意义。 实验结果表明: 1.本研究通过电融合法制各四倍体胚胎,二倍体胚胎、四倍体胚胎、添加GSH或p.巯基 醇后四倍体胚胎的囊胚率有显著升高。 2.TUNEL染色结果表明,四倍体胚胎的凋亡主要发生在囊胚期,凋亡率为13.2%,显著 高于二倍体胚胎(4.1%)。分别添加谷胱甘肽和B.巯基乙醇培养四倍体胚胎后,四倍体囊胚 的凋亡率分别为8.5%,9.4%,均有显著降低。 3.PCNA免疫荧光染色结果表明,四倍体胚胎的增殖能力在囊胚期最低,其PCNA阳性 率为73.8%,显著低于二倍体胚胎(94.2%),添加谷胱甘肽或B.巯基乙醇培养后,四倍体囊 胚的PCNA阳性率分别为85.5%,83.7%,均有显著提高。 4.RT-PCR的结果表明,促凋亡基因Bax在四倍体胚胎发育过程中,在囊胚期的mRNA 表达水平明显高于二倍体胚胎,添加谷胱甘肽或B.巯基乙醇后,Bax在囊胚期的表达显著降 低;抑凋亡基因Bcl.2在四倍体胚胎发育各时期表达无明显变化,加入谷胱甘肽或B.巯基乙 醇后,在桑葚胚期和囊胚期有显著增加;PCNA基因在二倍体胚胎各时期的表达量无明显变 化,在四倍体胚胎中,PCNA基因在二细胞期至桑葚胚期的表达量无明显变化,在囊胚期, PCNA的表达量降低。在培养液中添加谷胱甘肽或B.巯基乙醇对四倍体胚胎进行培养后, 东北农业大学理学硕士学位论文 PCNA在囊胚期的表达量明显上升。 通过上述实验结果可见,四倍体胚胎的凋亡与bax、bcl.2基因有关,PCNA的表达减少 也是影响其凋亡的一个原因,通过改善培养条件,在培养液中添加GSH或p·巯基乙醇,可 以显著地改善四倍体胚胎的发育,减少其凋亡的发生。 关键词:四倍体胚胎;电融合:细胞凋亡;谷胱甘肽;p·巯基乙醇 II Abstract Researchof ofMouse A

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