小鼠四倍体胚胎凋亡及GSH和β-巯基乙醇对其影响的研究.pdf

摘要 摘 要 stemcells，ESCs)是一种高度未分化细胞，它具有发育的全 胚胎干细胞(embryonic 能性，能分化出成体动物的各种组织和器官，又称为全能干细胞。小鼠二倍体胚胎可 以经过电融合等方法产生四倍体胚胎。四倍体胚胎的着床率虽高，但是发育至妊娠中期 的胎儿往往会出现面颅部畸型，而且几乎不能发育至足月。 利用ES细胞与四倍体胚胎可以形成嵌合体，在这种嵌合体中，ES细胞能参与胚体所有 组织的生成，而四倍体胚胎主要分布在胚外组织，如胎盘、滋养层、尿囊膜、卵黄囊膜等， 几乎不参与胎儿本身的形成。因此，将ES细胞与四倍体胚胎嵌合，使二者的发育潜能互相 补偿，就可能得到完全由ES细胞发育来的个体，其胚外组织则由四倍体胚胎形成。这种技 术称为四倍体胚胎补偿技术，得到的小鼠称为ES小鼠。四倍体补偿技术在获得基因突变小 鼠，分析突变基因的表型，以及证明iPS细胞的全能性等方面有重要的作用。 早期胚胎发育过程中存在大量发育异常的细胞。细胞凋亡是清除异常细胞的重要途径之 一。着床前胚胎的凋亡现象普遍存在，但大比率的凋亡对胚胎生长是不利的。因此，人们通 过向培养基中添加某些药物来减少胚胎细胞的凋亡，进而提高胚胎的存活能力。 本实验采用电融合法制作小鼠四倍体胚胎，用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末 端标记法(TI肥L)检测了二倍体和四倍体胚胎的凋亡，并采用RT．PCR和免疫荧光染色方 法检测了凋亡相关基因的表达情况，之后，在培养液中添加GSH或p．巯基乙醇培养四倍体 胚胎，检测它们对四倍体胚胎凋亡的影响。这对于研究小鼠四倍体胚胎早期发育情况，及获 得更多的优质四倍体胚胎有重要的意义。 实验结果表明： 1．本研究通过电融合法制各四倍体胚胎，二倍体胚胎、四倍体胚胎、添加GSH或p．巯基 醇后四倍体胚胎的囊胚率有显著升高。 2．TUNEL染色结果表明，四倍体胚胎的凋亡主要发生在囊胚期，凋亡率为13．2％，显著 高于二倍体胚胎(4．1％)。分别添加谷胱甘肽和B．巯基乙醇培养四倍体胚胎后，四倍体囊胚 的凋亡率分别为8．5％，9．4％，均有显著降低。 3．PCNA免疫荧光染色结果表明，四倍体胚胎的增殖能力在囊胚期最低，其PCNA阳性 率为73．8％，显著低于二倍体胚胎(94．2％)，添加谷胱甘肽或B．巯基乙醇培养后，四倍体囊 胚的PCNA阳性率分别为85．5％，83．7％，均有显著提高。 4．RT-PCR的结果表明，促凋亡基因Bax在四倍体胚胎发育过程中，在囊胚期的mRNA 表达水平明显高于二倍体胚胎，添加谷胱甘肽或B．巯基乙醇后，Bax在囊胚期的表达显著降 低；抑凋亡基因Bcl．2在四倍体胚胎发育各时期表达无明显变化，加入谷胱甘肽或B．巯基乙 醇后，在桑葚胚期和囊胚期有显著增加；PCNA基因在二倍体胚胎各时期的表达量无明显变 化，在四倍体胚胎中，PCNA基因在二细胞期至桑葚胚期的表达量无明显变化，在囊胚期， PCNA的表达量降低。在培养液中添加谷胱甘肽或B．巯基乙醇对四倍体胚胎进行培养后， 东北农业大学理学硕士学位论文 PCNA在囊胚期的表达量明显上升。 通过上述实验结果可见，四倍体胚胎的凋亡与bax、bcl．2基因有关，PCNA的表达减少 也是影响其凋亡的一个原因，通过改善培养条件，在培养液中添加GSH或p·巯基乙醇，可 以显著地改善四倍体胚胎的发育，减少其凋亡的发生。 关键词：四倍体胚胎；电融合：细胞凋亡；谷胱甘肽；p·巯基乙醇 II Abstract Researchof ofMouse Aptosis Tetraploid and theEffectofGSHand Embryos to 13-mercaptoethanolApoptosis Abstract