仪器分析笔记高效液相色谱分析.doc

第二章 高效液相色谱分析 §2.1 高效液相色谱法概述（掌握） 2.1.1 高效液相色谱法的特点 1、与经典液相色谱法比较 2、与气相色谱法比较 3、高效液相色谱法的发展 A、固定相的变化 填料粒度减小，粒型规整；键合型固定相；整体结构1.0μm填料的超高压液相色谱。 B、流动相变化 目前，出现120220℃超热水为流动相、FID和FPD检测器的HPLC。 C、全新方法 剪切流路液相色谱；不同分离机制组合的多维液相色HPLC与MS、NMR、IR联用的多维液相色谱法。 4、高效液相色谱法的特点 ①高压 ：采用高压输液设备，（150~350）× 105 Pa ②高速：分析速度快； ③高效：柱效很高。（n30000），可以在数分钟内完成数百种物质的分离 ④高灵敏度：10—9g（UV）；10—11g （荧光检测）。 5、高效液相色谱法的局限 ①溶剂用量太大； ②缺乏诸如气相色谱使用的TCD、FID通用型检测器； ③不能替代气相色谱法，难分离化合物(柱效10万以上)，必须使用毛细管气相色谱法进行分离； ④不能替代中、低压柱色谱法，一些生物活性化合物不能承受200kPa～1MPa压力。 §2.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素（了解） 2.2.1 影响色谱峰的扩展的因素 高效液相色谱法的基本概念及理论基础，与气相色谱法是基本一致的，其区别主要在于流动相的不同。现根据速率理论及色谱峰扩展及色谱分离的影响讨论如下： 高效液相色谱的范氏方程： 若将上式简化，可写作： 这与气相色谱的速率方程形式是基本一致的，主要区别在于纵向扩散项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质项。 1、涡流扩散项 式中——：填充不规则因子；：填料平均直径。 它与载体流速无关； 若柱子填充均匀，填料的颗粒也均匀，则柱效高；若填充不均匀，↗↗柱效低。 式中——：常数；：扩散系数；：流动项的线速度。 由于分子在液体中的扩散系数比在气体中要小4~5个数量级，因此在液相色谱中，当流动相线速度大于时，这个纵向扩散项对色谱峰扩展的影响实际上是可以忽略的，而气相色谱法中这一项却是重要的。 式中——：与（容量因子）有关的系数；：固定液厚度；：扩散系数。 固定相引起峰扩展解决办法： ①液液分配色谱：使用薄的固定相 ②吸附、排阻和离子交换色谱：使用小颗粒填料。 式中——Cm：常数（与k有关，其值取决于柱直径、形状和填充的填料结构）； Dm：流动相中扩散系数；dp：为填充物的平均直径。 ②滞留的流动相中的传质阻力项 原因：多孔固定相造成的部分流动相滞留。 式中——：常数（与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关）。 固定相的粒度其微孔孔径传质途径传质效率柱效。 2.2.2 液相色谱的曲线 1、液相色谱与气相色谱曲线的区别 ①HPLC板高H比GC小一个数量级，说明HPLC柱效高； ②对于HPLC 2、降低H，提高柱效的方法 ①减小填料粒度； ②减小填料孔穴深度； ③用低粘度溶剂作流动相； ④采用低速流动相（通常：）。 §2.3 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理（理解） 根据固定相和分离机理的不同，液相色谱法可分为： 1、液液分配色谱法（LLC） 2、液固吸附色谱法（LSC） 3、离子对色谱法（IPC） 4、离子交换色谱法（IEC）　 5、离子色谱法（IC） 6、空间排阻色谱法（SEC） 1、液—液分配色谱——基于组分在两相间的分配容量因子的差异而实现分离的。 A、固定相：载体+固定液 全多孔型担体 β，β-氧二丙腈 表面多孔型担体 聚乙二醇 异三十烷（角鲨烷） B、载体：硅胶； C、分类： 根据固定液和流动相（溶剂）的极性不同，可分为正相液液分配色谱和反相液液分配色谱。 为了避免固定相流失，固定相和流动相极性要相差大。（与GCGC：极性相似相溶 ） 分析对象与固定液极性一致； 正相色谱：固定液为极性，流动相为非极性 反相色谱：（应用最普及） 固定液为非极性，流动相为极性； 由于液—液分配色谱固定相易流失，现已被化学键合相色谱所替代。 D、原理： 由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，因而溶质在两相间进行分配。当达到平衡时，物质的分配同样服从下式： 式中——：分配系数；：容量因子；：溶质在固定相中的浓度；：溶质在流动相中 的浓度；Vm：流动相体积；VS固定相体积 E、应用：液—液色谱能分离多种类型化合物，如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物等。 2、化学键合固定相色谱 通过化学反应将有机基团键合到硅胶（载体）表面上，代替机械涂渍的液体固定相。 化学键合相色谱的出现，是HPLC的重大突破； 化学键合色谱是HP