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MeOH,ACN,THF似乎可以满足反相HPLC要求： 容易样品：ACN/水 一般样品：MeOH/水 THF/水 1选择标准梯度条件进行首次实验 乙腈/水5－100％25min,2ml/min或 乙腈/水5－100％50min,1ml/min 2 调整梯度范围，尽可能减少色谱图开始和结束时的时间浪费 3 如果色谱峰复杂，分离较差： 延长梯度时间 加长柱长 使用细粒度的柱 降低流速以提高塔板数 4 一旦色谱图中能容纳所用峰，改变流 速以调整峰间距 5 需要进一步改变谱峰间距，改变有机溶剂 色谱平衡 通常情况下，柱子用15～20柱体积的起始流动相充分冲洗后方可达到柱平衡。柱再生所需时间通常约等于梯度时间。 基线问题 等梯度HPLC 1 选择好填充柱 2 减小压力波动，避免冲撞击 3 用保护柱和在线过滤片 4 经常用强溶剂冲洗柱子：反相用1:1的异丙醇/氯仿，正相用甲醇 5 样品预处理，尽量减少无谓的强滞留成分和微粒 6 用较柔和的pH值3－7 ；防止键和相的流失 7 储存时冲洗掉盐缓冲液，以纯乙腈保存柱， 避免高浓度的水和醇类 1总论 2卓有成效的工作方法 3样品的性质和预处理 4分离的基础 5系统方法的建立 6保证柱寿命和性能的步骤 绝大多数实验室中，HPLC方法的建立仍在靠经验进行 首先进行反相色谱实验，调整流动相中有机相的比例，以求得足够的分离度、合理的操作时间以及易于检测的谱带。 改用不同的色谱柱，改变温度和流动相pH值，优化筛选溶剂的配比组成，以其它溶剂代替原来有机溶剂。或者试用别的HPLC方法 1 首先估价样品与分离目的（切不可低估此步的重要性） 2设计开始的分离条件，使之有可能在一两次实验中，便可能得到有希望的色谱图。 3 预测可能发生的问题，当问题出现时，能用已知的办法解决。 4 有限考虑试用最有希望的、能控制的分离方法。 5 应对每次实验进行设计，能提供有用信息。 6 HPLC的目的是分离，而不必使所需谱峰“过渡分离”。 可直接进样的样品溶液 需稀释缓冲pH或添加另一液体的溶液 能在流动相中溶解的固体 含有干扰物质或“损柱剂”而必须在进样前 将其去除的溶液 含有不容性赋性剂的混合物（动植物组织，高交联度聚合物、干性黏合剂） 绝大多数样品需经称重或稀释后进样，一般使最终样品液与流动相的成分尽量相近。 要分离好的好，有两条途径：一是谱带窄，即柱效高；再就是谱带间距离大。 Rs=(t2-t1)/[(1/2(w1+w2)] t1，t2 为二相邻谱带间的保留时间，w1和w2为它们基线处的峰宽。Rs为其分离度。Rs≥1.5时 为完全分离。 当峰发生重叠时，难以准确测量到基线处的峰宽，更的办法好是用半高处的相应峰宽?1和?2： Rs= 1.18(t2-t1)/ (?1+?2) Rs≥1.25在一般情况下，能达到≥99％的分离度。 新柱的起始色谱图的Rs值越大，意味着该柱用此法时间越长。 Rs≤1.0时 定量分析一般精密度较差。 Rs=(1/4)(?-1)N0.5[k’/(1+k’)] k’代表了溶剂强度；?为分离因子；N为理论塔板数。 溶剂强度的增大，Rs增大，满意的范围1 k’20 在反相HPLC中溶剂强度会随着水/有机流动相中的有机相增加而增加。 柱类型不同，选择性也不一样，这与键和相有关。 温度的选择性，温度的变化会影响分离度，因为理解的程度与温度有关。 一般塔板数越大，分离度越好 合格的HPLC的塔板数，一般不应低于标准值的80％，否则为不合格。 流速适中，过高会降低塔板数。 当流动相粘度增加时，塔板数会降低， 对于反相体系，水的粘度较高意味着在高温时操作有利于最大限度的增大塔板数，在50度时较好。 工作压力：低于150bar 操作时间：应尽可能短 峰高：只要检测灵敏度有限，需要窄而高的峰 溶剂应用：对日常工作、大量实验，每次进样少消耗流动相为好 保留值与分离度的重现性 1选柱时，应考虑其化学性质 2在流动相中用缓冲剂，以除去化学的或硅羟基效应，尽量减少谱峰拖尾。 3保证温度、流速、和压力、溶剂成分恒定 4脱气 5保证上样不超载 1～10ug/mg填料。 6使用同一批生产批号的材料 柱坏 污物在柱进口处堆积 样品超载 样品溶剂不合适 化学或次级保留效应 缓冲不足 重金属污染 进样阀体积过大 进样阀、色谱柱及检测器之间的管线过长或直径过粗 检测器流动池体积过大 1检测条件的选择 2梯度洗脱进行首次实验 3优化流动相的选择性 提高分离度有三种方法： 1 提高塔板数 2 改变有机相比例，以改变谱峰间距 3 更换流动相溶剂，以改变谱峰间距 一次初始的梯度操作通常足以判断出大约正确的