multiplex realtime pcrを用いた牛结核病の迅速 - 大分県.pdf

Multiplex Real Time PCR を用いた牛結核病のスクリーニング法の検討 大分県食肉衛生検査所 ○甲斐雅裕、西本清仁 １、はじめに 牛結核病はMycobacterium bovis （以下 M. bovis）を原因菌とする疾病で、と畜場法に 基づく全部廃棄対象疾病であるとともに、家畜伝染病予防法に基づく家畜伝染病でもある。 また、M. bovis は感染症法において結核の原因菌である結核菌群の うちの １つとして規定 されていることから、人獣共通感染症 として公衆衛生上も重要な病原菌である。 と畜検査 においては、肺や リンパ節において特徴的な病変である結核結節を認めた際に本病を疑 う が、類似の病変は非結核性抗酸菌感染症、放線菌症、アルカノバクテ リウム ・ピオゲネス 症等においても認められることから類症鑑別が必要である。しかし、M. bovis の発育速度 は極めて遅 く、培養検査による確定診断までには長時間を要することから、迅速な診断の ためには細菌培養 と併せて遺伝子学的なスクリーニング検査法の確立が必要である。そこ で今回、牛結核病の遺伝子学的スクリーニング法 として、M. bovis を含む結核菌群に加え て、鳥型結核菌群およびその他の抗酸菌群の鑑別が可能 と報告されているMultiplex Real Time PCR の有効性について検討 した。 ２、材料 と方法 （１）検体および前処理方法 ：M. bovis BCG の生菌である乾燥 BCG ワクチン （日本 BCG 0 -10 製造株式会社）12mg を 150 μl の滅菌生理食塩水に溶解 し、原液 （10 ）～10 までの段 階希釈液を作成 した。実際の結核病変組織を想定 して、10-4～10-10 の各希釈液を健康牛の 肺門リンパ節 20mg と混合 したものを検体 として用いた。各検体をホモジネー トチューブ （富士レビオ株式会社）に採取 し、クロラムフェニコール （0.05g/ml）およびアンピシリ ン （200mg/ml）を加えた滅菌蒸留水 300 μl を添加 した後、FastPrepFP20 （SAVANT） でホモジナイズ処理 （Speed:6.5、Time:45） した。これに 1%NaOH を 300 μl 添加後、 室温で 15 分静置 した上清を検体処理液 とした。 （２）培養方法 ：各検体処理液 100 μl を4ml の液体培地にそれぞれ接種 した。液体培地 にはMiddlebrook 7H9 Broth （Difco）を121℃10 分間高圧蒸気滅菌後、Middlebrook OADC Enrichment （BBL）および MGIT PANTA （BBL）を規定量添加 したものを用い、37℃ で好気培養を行った。 また、希釈液中のM. bovis のおおよその菌数把握のため 10-4～10-10 の各希釈液 100 μl を 3%小川培地にそれぞれ接種 し、37℃、1 ヶ月間好気培養後、コロニー数を測定 した。 （３）Multiplex Real Time PCR ：10-4～10-10 の各希釈液および培養開始 1 日目、3 日目、 6 日目、12 日目の培養液からそれぞれ 100 μl を 1.5ml チューブに採取し、12,000rpm、5 分遠心、上清除去後、アルカリボイル法によりDNA 抽出を行った。 Multiplex Real Time PCR は E. T. Richardson らの報告 ［1］に基づいて、結核菌群、 鳥型結核菌群およびその他の抗酸菌群のプライマーセットを用い、SYBR Green 法で行っ た。結核菌 （Mycobacterium tuberculosis）の positive control DNA template は大分県 衛生環境研究センターより、鳥型結核菌（Mycobacterium avium subsp. avium）の positive control DNA template は （独）農業 ・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究所よりそ れぞれ入手した。 （４）豚病変部を用いた抗酸菌培養および菌