荧光素标记探针的原位杂交示意图.ppt

三：荧光曲线出现下降 出现荧光曲线出现下降的现象，原因是加入样本后盖子没有盖严，或者在上机前用1.5ml EP管作套管离心后，盖子有所松动，使得在上机检测中管中液体蒸发出去，导致机器检测到的荧光信号衰减。 解决办法：在上机开始运行前，将小管盖子逐一按一遍。 四：检测数据异常 这里所说的异常是指不可控因素造成的， 1、停电或由于电压不稳可能出现的荧光曲线波动幅度较大等，而曲线波动较大也可能导致软件计算错误。 2、阳性曲线与阴性曲线差异巨大，但ST值差异较小，此ST值为非正常计算值，需注意，判错几率很大；反之阳性曲线与阴性曲线趋势相同，但ST值差异较大，判错几率也很大。这是极个别的情况。 谢谢！ 北京个体化药学服务平台 荧光染色原位杂交 原理及软件参数设置 中国健康促进基金会 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。 FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。? 杂交所用的探针大致可以分类三类： 1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测； 2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得； 3）特异性位置探针，开展个体化药学服务，就使用特异性位置探针，检测特定的SNP位点。? 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。 1）间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大。 2）直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合。直接标记法在检测时步骤简单，可以直接检测荧光信号。开展个体化药学服务，即采用荧光直接标记法。? **荧光原位杂交的特点：1）快速；2）信号强；3）特异性高；4）多色。**FISH有上述优点的原因： 使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统标记探针的物质：（1）间接标记：生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin) ——半抗原报告分子 （2）直接标记：荧光素  A 寡核苷酸探针： 3’端接有荧光素（红圈）， 5’端接有淬灭基团（红点） 未杂交时，成自身环状，不发出荧光。 3 5 Q + A 3 5 = T 模版 G 荧光素标记探针的原位杂交示意图 有特异核酸SNP位点的模板 杂交后，探针打开，淬灭基团原理荧光素，发出荧光 用荧光检测仪和荧光染色原位杂交， 实现SNP分型的原理 仪器原理： 探针和模版结合，发出荧光 通过内置CCD探头，接收荧光信号 通过软件分析处理，给出待检基因位点基因型 55℃ 56℃ 57℃ 58℃ 100% 50% 探针与模板的结合，符合一级动力学方程： A1（探针1）+B （模板） A1B （杂交分子） A2（探针2）+B （模板） A2B （杂交分子 A1为与模板完全互补的探针（假定长15mer），其Tm1值较高。 A2为与模板不完全互补的探针，与模板SNP不互补，假定长14mer，其Tm2值较低。 探针与模板聚合度 Tm1 Tm2 解链温度 A1（探针1）+B （模板） A1B （杂交分子） A2（探针2）+B （模板） A2B （杂交分子 （1）当体系中只有一个模板分子B，A1和A2探针各有一条时。A1与A2竞争