ee2和flu影响斑马鱼精巢发育和精子发生的差异性 - evcarexpocom.pdf

2016年 7月 重庆师范大学学报(自然科学版) Ju1．2016 第 33卷 第 4期 JournalofChongqingNormalUniversity(NaturalScience) Vo1．33 NO．4 DOI：10．11721／cqnuj2O16O431 EE2和 Flu影响斑马鱼精巢发育和精子发生的差异性机制 尹 盼 ，张群芳 ，李英文 ，刘智皓 (1．重庆师范大学 重庆市高校生物活性物质工程研究中心 重庆市高校动物生物学重点实验室，重庆 40133i 2．西南大学 淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆 400715) 摘要 ：用 150ng ·L-1环境雌激素 乙炔基雌二醇 (17a—ethinylestradiol，EE2)、300 g ·L 环境抗雄激素氟他胺 (Flu— tamide，Flu)单独处理 以及 150ng ·L EE2与 300 g ·L Flu联合处理对斑马鱼(Daniorerio)雄性成鱼进行 了30d浸 浴处理，并用组织学的方法检测了上述物质对斑马鱼精巢发育和精子发生的影响；同时，采用定量RT-PCR的方法研究了 EE2和 Flu影响斑马鱼精子发生的分子差异。组织学结果显示 ，EE2处理后斑马鱼精巢壁变厚，生殖细胞大量丢失；Flu 处理后精子细胞数量下降，出现空腔，早期生殖细胞数量有增加的趋势；联合处理组斑马鱼精巢生殖细胞数量急剧减少， 空腔化严重。定量 RT-PCR结果显示，所有药物处理均能显著下调鱼类发育和繁殖相关转录 因子基 因(dmrtl、s月 )和生 殖细胞标记基因(dmcl、nanos1)的表达(O．05)；EE2单独处理、EE2与Flu联合处理还能显著下调鱼类类固醇合成酶 基 因 50—1lfl、cypl9ala、cypl7al和cypl7a2的表达 (O．05)，Flu单独处理 只显著下调 了 50一jj 的表达水平 (p 0．05)，表现出一定的分子差异。研究提示EE2、Flu及两者联合处理均严重干扰斑马鱼精子发生过程，导致生殖细胞数量 明显下降；上述药物对斑马鱼类固醇合成及配子发生相关基 因表达 的影响既有相似之处，也有 明显不 同。 关键词 ：乙炔基雌二醇 ；氟他胺 ；斑马鱼；精巢发育；精子发生 ；基 因表达 中图分类号 ：Q175 文献标志码 ：A 文章编号 ：1672-6693(2016)04—0015-07 内分泌干扰物 (Endocrine—disruptingchemicals，EDCs)是指能模拟内源性激素的功能、干扰动物体正常内分 泌活动的化合物L1]，包括类雌激素、类雄激素 、抗雌激素、抗雄激素等 。水环境能接受许多来 自工厂 、农业、城市 的废水[6。]，因此 EDCs对终生生活在水体 中的生物尤其是鱼类的影响极为严重 。 目前主要研究的EDCs有两类 ：环境雌激素 (雌激素受体激动剂)和环境抗雄激素 (竞争性与雄激素受体结 合)。大量研究表明，不仅雌激素能影响雄性动物精巢发育，抗雄激素也能产生与雌激素相似 的效应[8]，如血浆 雌激素浓度上升 、精巢体积减小、精子发生延缓n “、雄性个体雌性化 、雌性性 比升高 ” 等。尽管雌激 素和抗雄激素能产生相似效应 ，但 已有研究表 明雌激素和抗雄激素影响鱼类精巢发育和精子发生的分子机制可 能具有一定差异口 ¨]。 为深入研究雌激素和抗雄激素诱导鱼类精巢发育和精子发生的差异性机制 ，本研究用环境雌激素乙炔基雌 二醇 (17a—ethinylestradio1，EE2)、环境抗雄激素氟他胺 (Flutamide，Flu)单独处理以及两者联合处理对雄性成年 斑马鱼 (Daniorerio)进行 30d浸浴处理，并用组织学和定量 RT—PCR的方法探讨 EE2和 Flu影响斑马鱼精巢 发育和精子发生的差异性机制 ，为最终消除水生环境 中EDCs的危害提供理论依据 。 1材料与方法 1．1实验试剂及仪器 EE2和 Flu购 自美国Sigma公司 ；总 RNA提取试剂盒 (Trizo1)购于 In