mf207-m5 ni-agarose his标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白).doc

M5 Ni-Agarose His标签蛋白 纯化试剂盒(可溶性蛋白)使用说明书 产品名称 单位 货号 M5 Ni-Agarose His标签蛋白 纯化试剂盒(可溶性蛋白) 5ml MF207-01 【STORAGE】 Protease Inhibitor Cocktail，-20°C；Ni-Agarose Resin，2-8°C，避免冷冻；其它组分，2-8°C 【产品简介】 本试剂盒包含Ni-Agarose填料、亲和柱空柱以及可溶性His融合蛋白纯化所需的全部试剂（细菌裂解液、蛋白酶抑制剂混合物、结合缓冲液和洗脱缓冲液组分），使用方便。该镍柱纯化系统对6×His-tag蛋白具有显著特异吸附能力，能够高效一步纯化带有6个组氨酸亲和标签的蛋白。该系统具有4个Ni2+螯合位点，较只有3个螯合位点的Ni-IDA结合Ni2+ 更 为牢固，有效防止纯化过程中Ni2+脱落且增强对His标签蛋白的结合能力，提高纯化效率。较高的基团密度，大大提高了蛋白载量。该系统在天然或变性条件下，对来源于各种表达系统（如杆状病毒，哺乳细胞，酵母以及细菌）中的His标签蛋白，均有很好的纯化效果。本产品已螯合镍离子，可直接用可溶性蛋白的纯化，使用方便，快捷。 支 持 物： CL-6B琼脂糖凝胶 载量： 20-30 mg His标签蛋白/ml填料 粒径： 50-160 μm 【产品组份】 5ml Ni-Agarose Resin 5 ml Bacterial Protein Extraction Reagent 65 ml 1M Tris-HC (pH7.9) 15ml 1M Imidazole 65ml 3M NaCl 120 ml Protease Inhibitor Cocktail 700μl Affinity Column (12ml) 1 set 【注意事项】 1．在纯化之前采用电泳检测蛋白的可溶性，本试剂盒只适合于可溶性蛋白的纯化，如需纯化包涵体蛋白，请选择我公司的包涵体蛋白纯化试剂盒，货号为MF206-01。 2．缓冲液中不建议使用 β-巯基乙醇、DTT和EDTA。 3．整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。 4．为提高纯化效率，首先确定Binding Buffer和Elution Buffer中咪唑的最佳使用浓度。必要时可以使用线性或梯度浓度的咪唑浓度，Binding Buffer的范围为0-10 mM，洗脱缓冲液的范围为10-500 mM来进行。并通过SDS或Western Blotting来检测目的蛋白的纯度。 5．请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过0.22 μm或者0.45 μm过滤器过滤。为避免柱子被堵塞，建议将裂解液进行离心，或者使用0.22 μm或者0.45 μm过滤器过滤。 6．柱再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。 【操作步骤】 A、缓冲液的准备 可溶性蛋白纯化缓冲液配方: 成分 Tris-HCl（PH 7.9） Imidazole NaCl Soluble Binding Buffer 20 mM 10 mM 0.5 M Soluble Elution Buffer 20 mM 500 mM 0.5 M B、组装层析柱 1．将Ni-Agarose Resin填料混匀后加入层析柱，室温静置10分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。 注意：1）填料的上层是乙醇保护层，将填料和乙醇一起混匀，以每ml填料纯化20-30mg His标签蛋白计算，取需要的填料与乙醇的混合液加入层析柱。 2）本实验是通过重力作用使溶液流出，如果溶液不流出，可以给柱子一个外力，例如用大拇指对柱口轻轻按压一下，迫使其流出。 2．向装填好的柱中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用10倍柱体积的Binding Buffer平衡柱子，平衡结束后即可上样。 注意：柱体积指的是填料的体积。 C、可溶性蛋白的纯化 1．收集菌体后，每100 mg菌体（湿重）加入1-5 ml细菌裂解液（每1 ml 细菌抽提试剂中已加入10 μl 蛋白酶抑制剂混