不同醛化红细胞检验鸡新城疫血清抗体的试验.docVIP

不同醛化方法制备的红细胞对鸡NDV的血凝对比试验 刘红波 河南科技学院动物科学系 新乡 (453003) 摘 要 在血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验中，传统的方法采用新鲜红细胞。由于新鲜红细胞容易破碎，保存时间短。每次试验需临时准备，使用很不方便。本文采用醛化红细胞进行新城疫的HA试验，并与新鲜红细胞进行对照。结果表明两种红细胞在新城疫的HA试验中的结果基本一致。另外，在传统的试验中做微量血凝试验则常采用PBS液作稀释剂，但是PBS液的PH值精密度要求较高。为了实验的操作方便，本作者就PBS液和生理盐水之间作了对比。其结果基本一致。现将结果报道如下： 关键词 醛化细胞 鸡新城疫病毒 滴度 1.材料与方法 1.1鸡新城疫病毒 均来自河南科技学院动物科学系预防兽医实验室 1红细胞一次吸附的新城疫病毒。为河南科技学院动物科学系预防兽医实验室自行配制 其具体方法[1]是：利用所收到的鸡胚尿囊液100ml加入0.2ml的1%已洗涤好的红细胞悬液，在室温下感作10-15分钟，随后加入少量生理盐水轻轻晃洗，倾弃悬浮红细胞后，置低倍显微镜下观察。阳性反应时红细胞粘附于感染的细胞表面。病毒大量增殖时，甚至可使整个单层细胞粘满红细胞。 1.1.2红细胞二次吸附的新城疫病毒：其具体方法是在一次吸附的基础上再进行一次吸附 1.1.3新城疫二系疫苗：北京市兽医生物药品厂出品 批号：109 1.1.4红细胞吸附上清： 5用PEG浓缩新城疫病毒[2]（2：1） 其具体方法是：尿囊液经离心1000r/min离心15分钟。吸取上清液加入10%PEG6000和2%的氯化钠轻轻摇动使二者溶解放入4摄氏度的冰箱中3小时后取出1000r/min。离心15分钟收集上清液，再以8000r/min，4摄氏度离心30分钟。弃去上清液，沉淀抗原加入原体积1/20的PBS液。PH为7.0使之悬浮。用超声波裂解器处理2分钟使病毒团块散开，最后按25%的浓度加入甘油溶液和1/10000的浓度加入硫柳汞备用。 1.1.6用PEG浓缩新城疫病毒（1：1）即病毒液与10%PEG的比例为1：1。方法同上。 7红细胞的处理：采自新乡县洪门镇菜市场周记烧鸡店的健康无病的公鸡血。 即取5只鸡的抗凝血，分成两部分；一部分使用灭菌生理盐水洗涤3-4次；另一部分使用PBS液洗涤3-4次，洗涤使用离心机2000r/min, 离心5-10分钟弃去上清液。配成1%的新鲜红细胞悬液。其它洗好的血球置到4-8摄氏度冰箱中备用。 8 PBS液[3]PH值要求为7.2-7.5 其配成置方法如下，称取氯化钠170克，磷酸二氢钾13.6克氢氧化钠3克。加蒸馏水1000ml装瓶121.3摄氏度灭菌20-30分钟。调PH值，即为PBS液原液，用时使用蒸馏水20倍稀释。 1.1.9 0.9%的生理盐水 均为自行配制，装瓶后置121.3摄氏度下灭菌20-30分钟备用。 1.1.10 甲醛 上海建新试剂厂 上海建信化工有限公司出品 批 戊二醛 上海化学试剂站分装厂 批号：Ⅱ-071-79 硫柳汞 为日本进口分装 上海化学试剂采购供应站试剂厂 批号：80-03-11 1.2醛化红细胞的制备 1.2.1甲醛醛化红细胞的制备[1] 取PBS液洗、生理盐水洗的血球各15ml。加入到甲醛：生理盐水为1：1的混合液30ml中即一份压积红细胞，两份甲醛生理盐水之后充分搅拌15min；置2-8摄氏度冰箱中48小时，每天振荡2-3次；48小时之后届时取出振荡摇匀以700r/min的速度离心5分 钟取出，弃去上清液加入相当于压积红细胞的20倍的生理盐水置2-8摄氏度冰箱中过夜，于次日取出弃去上清液，加20倍生理盐水洗涤三次。然后加入与压积红细胞等量的生理盐水完成整个醛化过程。 1.2.2戊二醛醛化红细胞的制备[5] 取PBS液洗、生理盐水洗的压积红细胞各8ml，各加92mlPBS液配成8%的红细胞悬液逐滴加入1%戊二醛（PBS液99ml+1ml戊二醛）充分搅拌17小时于次日取下用生理盐水洗涤4次2000r/min离心5-10分钟,弃去上清液。分成两份,一份为5ml；用生理盐水配成10%的红细胞悬液加入0.01%的硫柳汞防腐。即取5ml压积红细胞加入生理盐水45ml。完成醛化过程。 1.2.3戊二醛+甲醛二次醛化红细胞的制备 将1.2.2戊二醛醛化红细胞的制备方法中的另一份戊二醛醛化红细胞4ml加入甲醛：生理盐水为1：1的混合液8ml中，振荡15分钟后置4摄氏度的冰箱中过夜，48小时后取出充分振荡一次，1000r/min离心5-10分钟。加入20倍的生理盐水。置4-8摄氏度的冰箱中过夜。取出以2000r/min离心5-