第四课 药物代谢动力学.ppt

二 实验方法建立 （二）抗体的制备 5. 单克隆抗体（McAb）的制备及其在RIA中的应用 2）容易批量生产 一旦建立阳性克隆，便可通过扩大培养、动物接种等方法，大量生产均一抗体，每ml培养基的抗体时可达10～100μg，接种杂交瘤的动物血清或腹水，每ml可高达5～10 mg，相当于采用经典免疫法的数百只动物的产量，而且还可无限制的繁殖生产。 二 实验方法建立 （二）抗体的制备 5. 单克隆抗体（McAb）的制备及其在RIA中的应用 （3）McAb在体外分析中的应用 1）提纯抗原 利用McAb的高度特异性的优点，制备理想的亲和层析柱，可获得高纯度的抗原； 二 实验方法建立 （二）抗体的制备 5. 单克隆抗体（McAb）的制备及其在RIA中的应用 2）提高免疫分析的质量 McAb只和单一的抗原决定簇起反应，使检测的准确性显著提高；McAb的亲和常数单一，标准曲线的斜率较理想、稳定，提高了检测灵敏度，并有利于加强质量控制。 二 实验方法建立 （二）抗体的制备 5. 单克隆抗体（McAb）的制备及其在RIA中的应用 3）生产抗原来源困难的抗体 某些抗原如垂体激素，来源困难，量少价昂，若用常规免疫法生产抗体，抗原用量大，产生的抗体量亦有限，而用杂交瘤方法生产McAb，对抗原的纯度要求较低，抗原用量亦小。 二 实验方法建立 （三）放射性标记物 放射性标记物是体外放射分析中另一种重要试剂，它与放射免疫分析的灵敏度和精确度有着重要的关系。常用的标记核素有125I和3H， 二 实验方法建立 （三）放射性标记物 1. 对标记物的质量要求 （1）比活度（specific activity）：体外放射分析法的定量范围一般在10－9～10－12 mol水平，标记物的用量应等于或低于被测物的最小量，以得到较好的灵敏度。 二 实验方法建立 （三）放射性标记物 1. 对标记物的质量要求 使用的标记物的化学量越少，分析的灵敏度越高，但同时还需使每一反应管中有足够的放射性活度，以减少测量误差，因此，高比活度的标记物是确保分析方法灵敏度的前提。 二 实验方法建立 （三）放射性标记物 1. 对标记物的质量要求 （2）放射化学纯度（radiochemical purity）：放射化学纯度是指标记配体的放射性活度占标记产物总放射性活度的百分率。一般要求标记物的放射化学纯度在95%以上，若放射性杂质过多，标准曲线的斜率降低，将会影响测定的灵敏度。 二 实验方法建立 （三）放射性标记物 1. 对标记物的质量要求 （3）免疫活性（immune activity）：在标记过程中，许多因素可以造成标记物的损伤，同样，在储存过程中，也可能由于外界条件的变化而造成损伤，使标记抗原的免疫活性下降，与抗体发生反应的能力减弱，甚至丧失。 二 实验方法建立 （三）放射性标记物 1. 对标记物的质量要求 （4）稳定性（stability）：稳定性是指标记抗原在合理储存的条件下，保持其全部性能不变的程度。 二 实验方法建立 （四）分析方法 1. 反应方式 （1）平衡加样法（balance assay） 也称一步法，它是将非标记抗原、标记抗原和抗体同时加入反应体系进行反应，这种方式使非标记抗原、标记抗原二者与抗体有相同的反应几率。一般来说，平衡法反应的时间较长，灵敏度相对较差，但操作方便，精密度较好。 二 实验方法建立 （四）分析方法 2. 反应介质 放射免疫分析要在最适合的反应环境中才能得到最理想的测量结果，能否建立一个最适合的反应环境也是RIA成败的关键之一。 二 实验方法建立 （五）分离技术 在放免分析中，当抗原、抗体反应达到平衡后，必须将游离部分（F）与结合部分（B）分离，分别测定其放射性。因此能否选择合适的分离技术，将会直接影响分析结果的精密度和准确度。 二 实验方法建立 （五）分离技术 1. 双抗体法（double antibody method） 用抗原免疫动物（通常是兔）产生的抗体为第一抗体，这种抗体的主要成分是动物血清中的IgG，然后用生产第一抗体的同种正常动物的IgG作为抗原，再免疫另一种动物（通常为绵羊）产生的抗体称为第二抗体。 二 实验方法建立 （五）分离技术 1. 双抗体法（double antibody method） 在RIA中，当抗原、抗体反应达到平衡后，由于抗原和抗体的浓度都很低，抗原-抗体复合物的浓度也很低，而且处于可溶性状态，不能直接通过离心的方法加以分离。于反应体系中加入第二抗