罗非鱼无乳链球菌分离鉴定及致病性研究 - 水产学报.docVIP

罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及致病性研究 张新艳，樊海平，钟全福，卓玉琛，林 煜，曾占壮 （福建省淡水水产研究所，福建 福州350002） 摘要：从患暴发性流行病罗非鱼的肝脏中分离获得一株细菌TL60829NA；将TL60829NA对罗非鱼进行人工感染致病性试验，试验感染罗非鱼表现出自然发病症状，确认分离菌株为罗非鱼暴发性流行病的致病菌。分离株菌经形态学观察、Bio Merieux Vitek全自动微生物分析系统16S rRNA特异性基因16S rDNA序列构建的系统发育进化树显示，分离细菌与其它无乳链球菌的16S rDNA序列构成一个进化分支，而海豚链球菌则构成另一分支，确定分离菌株为无乳链球菌(Streptococcus agalaciate)。分离菌株对氨苄西林、青霉素G卡那霉素复方新诺明鳃小片结构崩解上皮增生融合肌纤维肌间白细胞浸润肝脏肠道膜上皮变性、坏死脱落固有膜炎性白细胞浸润肾脏大量嗜中性白细胞浸润swallowz47@163.com 通讯作者：樊海平TeL：0591E-mail：fanhaiping@ 斑块出血或溃疡，鳃盖内侧出血，肝脏、胆囊、脾脏肿大，严重时糜烂，肠道和胃积水或积黄色粘液。流行于春、夏和秋季，流行高峰为5～9月，流行水温25℃～37℃，主要危害亲鱼及100 g以上的幼鱼和成鱼，传染性强，发病率达10%～30%，死亡率达25%～80%，造成了严重的经济损失。本暴发性流行病的主要症状和流行情况与国内报道的罗非鱼海豚链球菌(Streptococcus iniae)病相似[1－3]，但国外报道罗非链球菌病的病原主要有无乳链球菌(S. agalaciate)和海豚链球菌 [4]。本文报道由无乳链球菌引起的养殖罗非鱼暴发性流行病的病原菌分离、鉴定和致病性等研究结果。 1 材料与方法 1.1试验材料 1.1.1试验用鱼 2006年8月，自广州鹭业水产公司狮岭罗非鱼养殖场采集具暴发性流行病典型症状的病鱼；试验用健康罗非鱼取自福建省淡水水产研究所融桥中试基地的健康罗非鱼(Oreochrimis niloticus ×Oaureus)，体重为150±10g。塑料袋充氧运回实验室，于水族箱暂养5d，暂养期间不投饵，连续充气，水温25℃～28℃，稳定后1周后供人工感染用。 1.1.2 培养基、试剂、药敏纸片 营养肉汤培养基、脑心浸液培养基（BHI）购自北京陆桥公司产品；血琼脂、胰蛋白胨、酵母浸粉、琼脂糖购自厦门泰京生物技术公司；Taq酶10×PCR缓冲液dNTP、pMD-18T载体、DNA Marker DL2000购自大连宝生物（Takara）公司；胶回收试剂盒、DH5α感受态细胞、无Dnase/Rnase水购自TIANGEN公司；引物fD1（5-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3），（5TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3）由上海鼎安测序公司合成；药敏纸片购自北京天坛中国药品生物制品检定所。 1.2 试验方法 1.2.1涂片检查病原体　　以无菌器具解剖病鱼，分别取鳃、肝脏、肾脏、脾脏、性腺、眼球等器官的小块组织，于洁净载玻片涂片，风干后，革兰氏染色，于Olympus CX41油镜下检查。 1.2.2病原菌的分离、纯化　　取活的具典型症状的病鱼，无菌生理盐水冲洗体表三遍，无菌解剖后，无菌接种环自肝脏、肾脏和体表溃疡处取样，BHI培养基平板划线涂布，28℃恒温培养36h～48h后，挑取形态一致的优势单菌落进一步划线纯化，直至获得纯培养物后，接种营养肉汤液体培养基，28℃恒温培养48h，加无菌甘油后，-80℃保存备用。 1.2.3 人工感染试验 取-80℃保存的试验用菌株接种BHI平板，28℃培养24 h，无菌生理盐水洗下培养物并10倍梯度稀释成不同浓度的菌悬液，腹腔注射暂养稳定后的试验用健康罗非鱼，每尾注射1.0mL，对照组注射等量生理盐水，每试验浓度组设置重复组。试验鱼放置于放水20 L的水族箱，每箱放鱼7尾，不换水，连续充气，每天观察记录鱼体死亡情况，捡除死鱼，连续观察14d。感染组出现典型症状的鱼体，按照1.2.2方法分离、纯化并保存细菌。 1.2.4 细菌形态观察及生理生化鉴定 取-80℃保存的菌株划线接种于普通营养琼脂、BHI平板和血琼脂平板，28℃培养24h后，观察菌落特征。取BHI平板培养24 h的培养物，革兰氏染色，Olympus CX41型显微镜观察。利用Bio Merieux Vitek全自动微生物分析系统16S rRNA基因的特异性扩增鉴定PCR基本通用引物5-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3），（5TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3）[6]，PCR基本过程如下：从挑取