木瓜凝乳蛋白酶基因克隆及其在毕赤酵母中表达分析.pdfVIP

摘要 摘 要 臻本蹑乳汁中至少含有翳糖半虢氨酸爨怠酶，即本蕊蛋白酶、本瓜凝乳蛋爨 酶、术瓜蛋白酶Q、甘氨酰被内切酶。木瓜凝乳蛋白酶在治疗骨质增生、Rh赢黧 鉴定、炎病的治疗、细胞分离以及医学研究等方面有非常重要的用途。由于这四 种半胱氨酸蛋白酶在结构、性质等方面十分相似，因谢从木瓜乳汁中分离木瓜凝 翼蛋鑫戆菲零困鼹。本磅突弱藕鏊透耋经羧零，将本燕凝鬟蛋自酶基因整合到举 赤酵母基因组中，构建了能够分泌表达木瓜凝乳蛋白酶的基因工程菌。 赤酵母表达载体pPIC9K多克隧位点序列缀成设计了一对特异性弓}橡。最后以及 转录产物为模板，通过优化PCR反应条件，克隆得到与嗣的基因大小～样的片段。 为了表达与天然蛋白大小一致的木瓜凝乳蛋白酶，通过重组反应姆木瓜凝乳 蛋自骜基因壹接撬入嚣表达载髂信号获绩璐彦癸磊嚣，掏建了重缀分泌表这载体 体上的外源基因片段测序并进行序列分析，证明克隆到载体pPIC9K上的外源基 因片段蠲受本瓜凝巍蛋鑫酶基魏。 法将它们导入毕淼酵母细胞中，使之熬合到毕赤酵母熬因组中。在无组氨酸的臀 养缺陷型平板上筛选阳性重缎转化子，将筛选褥到的转化予涂布到梯度浓度G418 平投．芝，逶一步筛选多拷买转豫子。这些鼗亿予经蓥落PCR方法分辑鉴定{芷鸹蒸 为重缀阳性转化予，同时，利用选择性平扳以及菌落PCR法鉴定这蝗重组转化子 表型，结果表明遮些转化子为Mut3表型转化子。 援据宿主蔻黧重组菌在不强生长慰矮培券滚孛纲艟密度绘裁宅爨生长藏线 圈，分析两者生长娩律，结聚袭明两者并凭太大差别。选取一株熏缀菌进行培养 并诱导表达外源激白，表达产物上清液缀浓缩后进行SDS—PAGE分析，并疑 Western blotting分析鉴定，结果表明重组菌培养液能够分泌表达木瓜凝乳蛋白酶。 关键词：木瓜凝乳蛋白酶，毕赤酵母，基因克隆，蛋白袭达 Abstract latexofCarica containsatleastfour four The proteinases．The papaya cysteine and are endopeptedase． glycyl papain，chymopapain，caricain proteinases has in treatment， hyperOsteogeny very application Chymopapain important ofRhblood of disease identification cancer,inflammatory group，accessorytherapy medical is similartothe treatment，celland very separation research．Chymopapain it to otherthree