水稻根系磷饥饿诱导基因的克隆及表达的分析.pdfVIP

浙江大学博士后研究工作报告 水稻根系磷饥饿诱导基因的克隆及表达的研究 摘 要 以水稻品种特三矮二号(Tesanai一2)为试验材料，采用抑制性扣除杂交技术 (SSH)构建了水稻根系磷饥饿诱导的扣除eDNA文库。经过文库筛选、序列测定 和同源性比较分析，获得18个已知功能基因和47个未知功能基因，对部分基因 进行了表达分析。同时，克隆到液泡质子ATP酶(V．ATPase)B亚基基因的全长 eDNA，对该基因的拷贝数、功能域、氨基酸同源性、磷饥饿条件下的表达模式进 行了研究。主要结果总结如下： 1．采用LD．PCR技术成功地合成了水稻根系的eDNA，用于抑制性扣除杂交。经 过两轮杂交和巢式PCR扩增，受磷饥饿诱导的差异表达的eDNA被扣除出来。 对照实验的结果表明，本研究中所进行的抑制性扣除杂交是成功的。 2．扣除后的eDNA经载体连接、转化、克隆挑选，构建了容量为10000个克隆的 eDNA原库，再经过以正向扣除cDNA和反向扣除eDNA为探针进行的点杂交， 筛选到650个阳性克隆。 3．对阳性克隆进行测序和同源性比较后，共发现18个已知功能基因和47个未知 功能基因。在已知基因中，主要涉及到五个方面的代谢过程：磷的吸收和转运、 信号传递、蛋白合成和降解、胁迫反应、碳循环。 4．部分已知功能基因和未知功能基因的Northern分析表明，所有分析的基因均在 磷饥饿的诱导下表达增强，不同基因的表达时间和部位有所差异。 5．磷饥饿诱导的已知功能基因与植物耐低磷的关系分析如下：磷酸盐转运体和 V．ATPase的增强表达促进了植物对磷的吸收和体内磷的跨膜转运；GTP结合 蛋白和蛋白激酶可能参与了植物对缺磷信号的感受和传递过程；翻译延伸因 子、蛋白酶体和泛素的诱导增强表明，在植物的耐低磷反应中可能存在一个快 反应蛋白的产生暗示，在植物的抗逆反应中可能存在一条共同的代谢途径；葡 聚糖合成酶和磷酸甘油酸变位酶的增强表达表明，植物根系中的碳代谢有所增 强，有利于根系在低磷条件下的加速生长。 列中存在一个保守的ATP结合位点。该基因已在NCBI登录，登录号码为 浙江大学博士后研究Z-作报告 水稻根系磷饥饿诱导基因的克隆及表迭的研究 AF’375052。 B亚基基因在水稻基因组中为单 7．基因组DNA的Southem分析表明，V．ATPase 拷贝。氨基酸同源性分析发现，V—ATPaseB亚基在不同的物种间的同源性在 75．97％之间，是一个较为保守的蛋白亚基，聚类分析还表明该蛋白的进化过程 是伴随生物的进化过程同步进行的。 8．Northem分析发现，V—ATPaseB亚基在水稻根系中受磷饥饿诱导的表达高峰出 现较快(6-12小时)，在叶片中表达高峰有所滞后(24—48小时)。在磷饥饿条 件下，V。ATPase通过提高其表达量，进而提高质子转运活性，形成跨膜的电 化学梯度，为体内储备磷的跨液泡膜运输提供能量，从而提高植物对低磷的耐 受力。 关键词：水稻，磷饥饿，抑制性扣除杂交，cDNA文库，基因克隆 苎!苎堂堕主生堡壅三竺!垦童 查塑堡墨壁塾堡堡兰垄璺塑垒堕墨查竺塑塑壅 Abstract a sativa Using Tesanai一2as rice(Oryza L．)cultivar material，a phosphorus starvationinduced subtractive eDNA wasconstructed the