细胞显微操作技术x.PPT

一、目的要求 练习针刺细胞（未受精卵、去卵核、早期胚胎细胞或体外培养细胞） 练习微吸管制备； 了解显微移植技术（细胞核、外源基因） 二、原理 采用显微操作系统（倒置显微镜/体视显微镜+显微操作器）将供体物（基因、细胞核或细胞其他成分）直接注入宿主细胞（去核卵母细胞、胚胎细胞或体外培养的细胞）中，研究供体物的功能或者获得转基因动物的技术。 实验四 细胞显微操作技术 显微操作仪 供体细胞的细胞核移入卵母细胞后，在卵母细胞相关因子的作用下，发生了重编程回复到发育的起点状态。 核重编程的过程就是使在体细胞中被关闭，而在正常胚胎发育中表达的基因重新被激活的过程 重编程有三种可能的结果 （1）供核基因组完全没有进行重编程，重构胚很快死亡； （2）部分重编程，重构胚在不同的发育阶段死亡 ； （3）完全重编程，产生正常的克隆动物。 核移植的机理 多莉的诞生过程 利用显微操作系统将外源目的基因（DNA或RNA）直接注入到受体细胞或受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，培养/筛选，获得转基因动物/性状分析； 显微注射是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制, 可达100kb；实验周期相对比较短。它的不足之处是：需要昂贵精密的设备；显微注射操作复杂；导入外源基因整合位点和拷贝数无法控制；常导致插入位点附近宿主DNA 片段缺失、重组等突变，可造成动物严重的生理缺陷。 外源基因导入（基因沉默、过表达、转基因动物） 三、实验材料 斑马鱼 Danio sp.胚胎 2-cell 4-cell 8-cell 主要仪器和用具 倒置显微镜；显微操作仪；拉针仪 主要试剂 酚红 四、显微注射操作过程 注射针内装液 （1）使用无菌的微量加样器从微注射针的后部加入待注射样品； 注射针安装和定位 （1）将装液后的针头的游离端安在连接器上，然后旋紧连接器以固定针头，再将其固定到微操作仪的托针管上； （2）把载有待注射样本的培养皿放在显微镜载物台上，用低倍物镜对准细胞调焦； （3）移动针头并在显微镜下调整微操作仪，直到针头的阴影在视野的中心上方； （4）使用工作用放大倍数，调准细胞焦距，找到针尖。 显微注射 （1）使针尖对准细胞的待注射部位（细胞与针尖在同一焦面上），旋转推进旋钮，针刺入细胞内（卵膜、细胞膜、核膜）； （2）旋转加样旋钮，将样本加入，并离开细胞。 作 业 简述细胞显微注射过程以及注意事项 显微拍照注射前后的胚胎 显微操作技术 micromanipulation technique 是克隆动物的基本技术支撑；包括细胞核移植、显微注射、嵌合体、胚胎移植以及显微切割等。 显微注射是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制, 可达100kb ；实验周期相对比较短。它的不足之处是：需要昂贵精密的设备；显微注射操作复杂，需专门技术人员；导入外源基因整合位点和拷贝数无法控制；常导致插入位点附近宿主DNA 片段缺失、重组等突变，可造成动物严重的生理缺陷。尽管如此，由于显微注射技术直接对基因进行操作，整合率较高，仍是目前建立转基因动物极为重要的方法。 显微注射技术在植物、动物的细胞发育研究中的应用，为研究体内生理和体外的生化过程架起桥梁，将特定的分子探针及衍生的细胞间质成分导入活体细胞，为研究细胞功能的调控机制提供了新的视野。 * leica 细胞核移植技术已有几十年的历史，1952 年，Briggs和King等将不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚。Gordon（1962）证明原肠胚以后的细胞核移植能发育到成体。1997年，Wilmut等克隆了绵羊Dolly。 尽管如此，由于显微注射技术直接对基因进行操作，整合率较高，仍是目前建立转基因动物极为重要的方法。 是克隆动物的基本技术支撑 注射速度过快将扰乱细胞质成分，造成细胞裂解或细胞从底层移位。 显微操作技术 micromanipulation technique 是克隆动物的基本技术支撑；包括细胞核移植、显微注射、嵌合体、胚胎移植以及显微切割等。 显微注射是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制, 可达100kb ；实验周期相对比较短。它的不足之处是：需要昂贵精密的设备；显微注射操作复杂，需专门技术人员；导入外源基因整合位点和拷贝数无法控制；常导致插入位点附近宿主DNA 片段缺失、重组等突变，可造成动物严重的生理缺陷。尽管如此，由于显微注射技术直接对基因进行操作，整合率较高，仍是目前建立转基因动物极