重组HLA-G1基因的克隆、原核表达、纯化及功能的初步分析.pdfVIP

摘要 HLA—G是一种非经典的HLA—I类分子，与人类免疫耐受有关。诱导对移植抗原的免疫 耐受是使移植物获得长期存活的关键。人类和哺乳动物的妊娠过程是自然界中存在的一种天 然的同种、}异体免疫耐受模型。在母胎界面的细胞滋养层上高表达的HLA—G能够抑制子宫蜕 膜NK细胞的杀伤活一陛，在保护胎儿不被母体排斥的过程中具有重要的作用。但HLA—G究竟 是哪些特定构象或氨基酸同Nl(细胞上其特异性受体相互作用，目前尚没有明确的结论。我 们研究的日的就是通过比较正常和特定氨基酸的突变的HLA—G分子与特异性受体之间的作 用力的强弱及功能活性变化米探讨HLA—G与其受体的作用机制。 本研究用基冈丁程技术将BirA酶底物肽(BSP)的编码基因克隆到M}lC分子上，利用 其与生物素特异性稳定结合的能力及生物素的多价性，将姗C分子捆绑成四聚体复合物，从 而在MHC分子与K1R结合的过程中从而标记和识别NK细胞。本试验研究的目的就是构建 和表达该融合蛋白，为HLA—GI与其受体的作用机制研究奠定基础。 研究利用PCR的方法分别扩增了HLA—GI的胞外功能基闪}IlBSP基冈，用SOEPCR将它们 融合蛋白羊¨hB2M分别于诱导5h，3h，两蛋白均以包涵体的形式得到了大量的表达。SDS—PAGE 电泳显示其分子最分别为36kD和1lkD，与预期相符。在Westernblot免疫印迹分析，融合蛋 B 白与87G单克隆抗体，h2M与其腹水多克隆抗体发生特异性反应。由丁融合蛋白在大肠杆菌 中表达始终形成包涵体，而HLA—G胞外区本身含有两个二硫键，给为蛋白质正确折叠造成很 人困难，因此，在对表达产物形成的包涵体溶解、洗涤、复性等一系列过程中，摸索出融合 萤RHLA—G1复性的最适条件，提高其复性率。融合蛋白包涵体经6mol／L的尿素溶解后用C∥+ B 离子树脂纯化，获得理想的纯化效果。h 2M蛋白包涵体经洗涤溶解后目的蛋白浓度占全部 包涵体蛋自的30％，满足辅助HLA—G1融合蛋白复性的要求。 霞组融合蛋白HLA—G1在与hB2M稀释法共复性，超滤浓缩后，在10ug／ml的浓度下， 分别以NK92和K562细胞为效应细胞和靶细胞，在5：1和2．5：1的效靶比例下，用乳酸脱 ug／m1HLA_Gl融合蛋 氢酶法(I,DH法)测定Nl(细胞对K562细胞的杀伤活性。结果表明lO u 白能显著抑制NK细胞的杀伤活性．加入1．9 HLA—G1融合蛋白抗体87G能阻断大部分 g／ml HLA—G1的抑制活性。 关键词：HLA．G1，BSP，ha：M，表达，免疫耐受 Abstract inimmunotolerance．The HLA．Gisanon—classicalMHCclassicalImoleculeinvolved inductionofimmuno-toleraceof isthe to survivalof foreigngrafts key long-term transplanted in tissue．The of hasbeen inhibited hyperacuterejectionforeigngrafts greatly xenotransplantation natural and inhibitor duetothe the antibodybyusing complements．Butpresence byeliminating of of