利用Ion半导体测序开展RNA-Seq的灵敏度.PDF

利用Ion半导体测序 开展RNA-Seq的灵敏度 与芯片和qPCR的比较 RNA测序(RNA-Seq)技术的最新进展 在本研究中，我们根据Ion个人化操作基因组(PGM™)测序仪所产生的读取深度 使得研究人员能够鉴定整个转录组， 和RNA-Seq数据确定了灵敏度和动态范围。我们使用了利用同一RNA样品的五 比测定基因表达的传统平台要全面得 次单独测序运行所产生的增量数据。在对一组已经经过芯片质量控制(MAQC)研 多[1, 2]。RNA-Seq不受限于预定义的 究证明所有芯片平台均可检测到的基因集合进行比较时[4] ，我们证明，凭借可 转录本注释 因此不仅能定量已知的 定位到人类基因的200万个序列读取，Ion半导体测序上RNA-Seq的灵敏度超过 ， 转录本 还能发现新的外显子和其他 了芯片。 ， 剪接形式 此外 RNA-Seq实验所产 。 ， 生的数据是离散的计数数据 故动态 为了进一步研究灵敏度的差异，我们测定了Ion PGM™测序仪上的RNA-Seq、 ， 范围在理论上没有限制 因此 随着 芯片以及TaqMan ®定量PCR (qPCR) assay在检测表达差异显著基因上的一致 。 ， 测序深度增加 灵敏度和每个碱基的 性。我们认为，差异表达基因的表达水平在几个平台中呈现出高度相关。 ， 覆盖度也增加 可实现低丰度转录本 ， 的定量以及开展更专业应用(如等位基 材料与方法 因特异的表达)的能力[3]。 文库制备 RNA-Seq文库是从Ambion® Human Brain Reference (HBRR) 和Stratagene® Universal Human Reference (UHRR)总RNA制备而来的，这些也用于MAQC研 究。随后利用Ambion® MicroPoly (A) Purist™ Kit选择了添加到总RNA样品中的 外部RNA加标对照(ERCC) [5]和mRNA转录本。根据Ion Total RNA-Seq Kit用户 手册制备文库[6, 7]。 测序 利用Ion Xpress™ Template Kit v2.0和Ion Sequencing™ Kit v2.0 ，根据已发布 的用户手册开展模板制备和测序反应。我们对HBRR和UHRR样品的五次技术平 行重复进行了测序，因此在Ion PGM™测序仪上运行了十块Ion 316™芯片。利 用Torrent Server Suite开展数据提取和碱基检出(附录A) ，产生了十个FASTQ文 件，这些文件包含了单个碱基检出及每个读取的相关质量值(根据位置)。 序列质量调整、定位和计数 为了获得外部加标转录本的读取计 E R C C 转录本库是以已知滴度配置 每个FASTQ文件经过最短序列长度的 数 我们将ERCC序列添加到基因组 的 旨在代表大的表达水平动态范 ， ， 过滤 并从每个读取的3 端读入 根 定位参考序列中 并直接比对单个读 围 利用这一信息 我们可通过线性 ， ， ， 。 ， 据每个碱基检出相关的质量值过滤 取 这样可以从每个TMAP生成的SAM 回归分析比较定位到每个ERCC转录 。 ， 这是利用FASTX-工具箱实现的[8]。如 比对文件中轻松提取每个ERCC转录本 本的读取计数 以R平方值和斜率作