实时荧光定量PCR原理、操作及其应用.ppt

三、荧光定量PCR技术的应用 2、相对定量分析及实验方案 研究基因表达的情况，我们只需搞清楚该基因在不同生理阶段的变化趋势如何就行了，而无需知道该基因的绝对量有多少。基因表达调控研究中，由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，这就造成了比较上的混乱，因此在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。所谓的看家基因即内参基因，是指在各生理阶段表达量恒定的基因，也称奢侈基因，该基因表达一般不随外界的变化而变化，所以常被用作参照，常用的内参基因有GAPDH基因、β-Actin基因，18srRNA基因等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。 假定在1生理时期，X基因的表达量为X1；其内参基因表达量为Y1；X1/Y1就将1生理时期的取样、RNA提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；同样在2生理时期，X2/Y2就将2生理时期的取样、RNA提取、纯化、反转录等过程的所有偏差均一化了；最后（X1/Y1）/（X2/Y2），所得的值就能就能较为真实的反应在1、2生理时期，X基因的变化情况。 常用的相对定量方法主要有两种，双标准曲线法和Delta-delta Ct法。 三、荧光定量PCR技术的应用 2、相对定量分析及