建立高效液相色谱鄄串联质谱检测细胞内腺苷酸浓度的方法及其应用.pdfVIP

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2013, 40(3): 273~280 立高效液相色谱 串联质谱检测 细胞内腺苷酸浓度的方法及其应用* 1) 2) 1)** 3) 1) 1) 李宁 张海涛 罗 辉 张良滔 熊 勇 贾振斌 1) 2) ( 东医学院化学教研室，湛江524023 ； 东医学院生物化学与分子生物学研究所，湛江524023； 3) 东医学院分析中心，湛江524023) 摘要 细胞内腺苷酸浓度变化是细胞能量代谢改变的感应器，建立高效液相色谱- 串联质谱法检测细胞内腺苷酸浓度的 方法有助于监测药物对细胞能量代谢的影响 用含有Na-EDTA 的高氯酸溶液超声裂解细胞 采用超高效HSS T3 色谱柱 (2.1 mm 100 mm, 1.8 滋m) ，以8 mmol/L N, N- 二甲基己胺(DMHA)水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱，采用正离子模 质 谱检测，在多反应监测(MRM)模式下进行定性定量分析 结果表明，AMP 、ADP 和ATP 分别在(0.1814～14.5164) 滋mol/L、 (0.2342～18.7354) 滋mol/L 和(0.2003～16.0260) 滋mol/L 线性范围内具有良好的线性关系，其相关系数分别为0.9984、0.9964 和0.9990 AMP、ADP 和ATP 的检出限(LOD， / 3)分别为 1.9291、1.8794 和 166.5 nmol/L，定量限(LOQ， / 10) 为 S N S N 1.9632、1.9672 和185.6 nmol/L，且加标回收率为81.8% ～107.8%，相对标准偏差小于7.55% AMP、ADP 和ATP 的日内偏 差(RSD)分别为6.16%、5.13%和7.66%，日间偏差(RSD)分别为6.36% 、2.74%和6.77% 该方法快速、简单、灵敏，能满足 细胞内AMP、ADP 和ATP 含量的检测要求 通过检测分析在不同浓度高良姜挥发油作用下人肺癌A549 细胞内AMP、ADP 和ATP 含量变化，结果显示细胞总的腺苷酸水平和能荷呈浓度依赖性下降，且当浓度达到500 mg/L 时ATP/TAN 明显下降， 而A549 细胞中AMP/ATP 比例水平呈浓度依赖性增加 这提示高良姜挥发油可通过影响细胞能量代谢抑制细胞增殖 关键词 高效液相色谱- 串联质谱，腺苷酸，能量代谢，高良姜 学科分类号 O65，Q5 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2012.00 186 腺苷酸，包括三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷 HPLC 可克服这一问题[10-11] 细胞样品中成分复杂， [12] (ADP)和单磷酸腺苷(AMP)是监测细胞内能量代谢 影响检测的因素多 ，需要建立一种灵敏度高、精 变化的化合物，腺苷酸作为能量供给和反应底物参 确度佳的检测腺苷酸微量浓度变化的方法 采用离 与各种细胞内的生化过程[1-2] 建立灵敏和可信的 子对高效液相色谱/ 质谱(HPLC-MS/MS)联用技术， 分析方法检测细胞内微量的腺苷酸浓度变化，准确 应用超高效HSS T3 液相柱有助于ATP、ADP 和 获取细胞内能量代谢信息，评价细胞能量代谢状 AMP 3 种腺苷酸的保留和分离，同时多反应监测 态，有助于阐明细胞增殖和凋亡的分子机制 目前 扫描方