测定葡萄糖酶活性.pptVIP

实验三;一、目的和内容 目的：学习测定糖化酶活力的原理并掌握 测定糖化酶活力的方法 内容：１. 学习糖化酶活力的原理． 　　　２. 测定并计算糖化酶活力．;二、糖化酶简介以及其活性的测定原理;① 糖化酶的应用与生产 糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶（Glucoamylase EC.3.2.1.3），又名淀粉葡萄糖苷（Amyloglucosidase）或γ-淀粉酶（γ-amylase），是一种含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60～1000kDa 之间。因发酵工业中大量用作淀粉糖化剂，习惯上简称糖化酶。;糖化酶在工业生产中的应用： 糖化酶是淀粉糖化发酵生产酒精和葡萄糖浆的主要酶类。特别是酿酒酵母利用淀粉原料发酵时，淀粉液化后的糖化作用是必不可少的工序，因为大多数酿酒酵母只能利用可发酵的糖进行酒精发酵。 糖化酶不仅用于酒类、酒精生产和葡萄糖浆的制取，还广泛地用于抗生素、氨基酸、有机酸的生产。糖化酶是我国产量最大、应用最广的酶制剂之一。;目前，工业中广泛使用黑曲霉(Aspergillus niger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米根霉(Rhizopus oryzae)和臭曲霉(Aspergillus foetidus)为生产菌株来发酵生产糖化酶。 今天的实验用酶就是利用黑曲霉变异菌株进行液体深层通风发酵后提取获得。 ;②糖化酶的作用机制 糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，与之相对的都是非还原端）依次水解a- 1,4 糖苷键, 切下一个个葡萄糖单元，并像β- 淀粉酶一样, 使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成β- D- 葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a- 1,6 糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a- 1,3 连接的碳链，但水解a- 1,4 糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。; ③酶活测定方法测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱农法（ＳＰ法） 、Schoorl法（ＤＵ法）和对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）、3,5-二硝基水杨酸(DNS) 等方法。 本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下（pH范围是4～6, 温度范围是40～60℃）进行反应，生成的葡萄糖用次碘酸钠法定量测定。以单位时间内分解α–１，４糖苷键生成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。;次碘酸钠法：;注释：;I2;三、试剂与器材 1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角瓶、pH计、电子天平； 3.试剂 2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋酸缓冲液； 0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化钠溶液； 2mol/L硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5%淀粉指示剂。;四、操作步骤 1. 取7个带塞的试管（其中3个测今年批次的酶活、另外3个测去年批次的酶活、1个作空白对照），分别吸取2%可溶性淀粉液5ml，加入pH4.6醋酸缓冲液2.5ml，混匀后于40 ℃水浴中预热10min。 2. 加入酶液0.5ml（空白对照组以煮沸失活的酶液代替）于40 ℃，反应10min；反应结束时，立即于沸水浴加热5min使酶失活(此时应将试管的塞子打开）。;3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液5ml，缓慢加入0.1mol/L NaOH溶液 5ml (注意:加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧化C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) ，摇匀后在暗处放置15min后加入2mol/L硫酸2ml； 4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可），用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶液样品（A）、空白对照（B）；;5.计算： (1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶液生成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：;（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2%淀粉溶液水解生成1μmol葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位（U）： 酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3 ×（N/2）×（8/5）×106×2 ×（1/10） 式中符号与前式相同， 其中： 10-3—— ml换算成L。 106—— μmol换算成mol。 ;五、实验报告 将重复3次测定的糖化酶活力结果记录在实验报告中，并按提供的两种计算公式分别计算出酶活力。 六、问题和思考 1. 糖化酶的作用有何特点？ 2. 你