NAi干扰及其应用.pptVIP

（3）用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA 选择通常是200—1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA? RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs 除掉没有被消化的dsRNA siRNA混合物直接转染细胞 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型 不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗 * Ku-70 levels were reduced 86% in cells transfected with the siRNA cocktail, compared to non-transfected controls. * （4）siRNA表达载体 多数的siRNA表达载体依赖3种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹siRNA在哺乳动物细胞中的表达。包括的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。 之所以采用RNA pol III启动子是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。 使用这类载体，需要2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。 最适用于：已知一个有效的siRNA序列，需要维持较长时间的基因沉默，或