石蜡制片电镜徒手切片法.pptVIP

（八）观察 喷好的样品就可以用扫描电镜进行观察了（一般20kv）。如果一时不能观察，需把样品放入干燥器中保存，以防受潮或被污染。 OK！ 扫描电子显微镜 苹果花粉粒 蜀葵花粉粒 一串红花粉粒 二、透射电镜制片基本方法（超薄切片） （一）取样 要求取样要有代表性、迅速、准确、及时、体积小、低温、防损伤。一般要求体积0.5-1.0mm2。 （二）固定 目的是要在分子水平上真实的保存细胞超微结构的每一细节。常用的方法是化学固定法，目前大部分植物材料采用的固定方法是戊二醛—锇酸双固定法，即先用戊二醛作预固定，然后用锇酸作后固定。对于一般植物叶、幼茎、幼根可用3%的戊二醛固定2小时，用1-2%四氧化锇固定2-3小时。 （三）脱水 常用的脱水方法是逐级脱水，即采用的脱水剂浓度梯度为30%→50%→70%→80%→90%→95%→100%（100% 浓度中换3次），常用的脱水剂为乙醇或丙酮。每一级脱水剂中停留时间为10-20min，脱水剂用量一般为样品体积的10倍以上。 （四）渗透与包埋 将脱完水的组织先后经过脱水剂和环氧树脂渗透液（是常用的包埋剂，目前常用的型号为Epon812），比例分别为3：1→1：1→1：3，每步30-60min。将渗透好的样品块放到适当模具中，灌上包埋液包埋，经过加温聚合形成一种固体基质（也叫包埋块），已备切片。 （六）超薄切片 标准的超薄切片应该是厚度适中、均匀、平整、无刀痕、无颤纹和皱褶。基本步骤为：准备切片刀和铜网→修整包埋块→切片→捞片。 铜网准备：超薄切片要放在载网上才能进行染色等操作，并最终放到电镜中观察。载网是用无磁性金属材料做成的，厚50微米，直径一般为3mm，一般用铜材料，所以又叫铜网。铜网要经过清洗，方可使用。目前清洗方法主要有：超声波清洗法、酸碱清洗法。 支持膜的准备：铜网的网孔很小，但对于放置超薄切片及其他样品来说，网孔还嫌大，不足以平坦地支持切片，所以要在铜网上覆一层透明的膜——支持膜。 切片刀准备：超薄切片刀有两种，一是金刚刀，二是玻璃刀。前者价格昂贵、质地坚硬、经久耐用；后者制作方便、价格低廉、但刀刃较脆、不耐用、不能切硬质材料。制刀用玻璃为硬质玻璃，含硅量72-75%以上。 切片：是用超薄切片机切出50nm后左右的超薄切片，以供观察。 展片与捞片：切下的超薄切片漂浮在刀槽液面上，需要将它捞至于铜网上，才能染色和电镜观察。由于切片很薄，在切片过程中易皱褶，使样品结构重叠，因此在捞片前需进行展片。捞片后，用滤纸吸去多余水分，然后将载网放入样品盒，至于干燥器中保存，待染色。 （七）切片染色（电子染色） 要进行电子染色后才利于电镜观察。所谓电子染色是使铀、铅、锇、钨等重金属盐类中的重金属与组织中某些成分结合或被吸附，以此达到染色目的。经过电子染色处理可以提高样品的反差，增加图像的清晰度。常用的电子染色剂有醋酸铀和铅盐。常用的染色方法是双染色法，即先用醋酸铀染色，然后再用柠檬酸铅染色。染色时间，室温下染色15-20min。 （八）电镜观察 染色完成的样品立即上机观察，如受时间限制，样品应放置于干燥器中防受潮。 * * 第五章 园艺植物制片方法 植物制片是进行园艺植物科学研究所需用的一种基本方法，比如进行植物各个器官的解剖构造观察、花芽分化研究、授粉受精观察、贮藏营养观测以及染色体观察等都需要进行制片。通过对切片结果的分析，可以比较不同试验处理的效果以及了解不同树种和品种相应的生物学特性等。植物制片技术是一个相对独立的体系，内容繁多。在本章内容中，将介绍在园艺植物科学研究中常用的一些基本方法和原理。 第一节 徒手制片 一、徒手制片（切片）及特点 徒手制片一般指徒手用刀片把新鲜的植物材料切成薄片的制片方法。 此制片法主要优点是：（1）能及时观察研究植物生活组织的结构和天然色彩；（2）方法及用具简单，不需切片机等机械设备，短时间即可完成。主要缺点是（1）对于微小、柔软、水分过多以及坚硬的材料，难以用徒手切成薄片；（2）对于操作不熟练者，往往切成厚薄不匀或不完整的切片。 二、徒手制片的方法及注意事项 徒手制片最主要的工具就是刀片，常可用单面保安刀片。要获得良好的切片，首先要保持刀口的锋利。切片方法及步骤为： （1）准备工作（盛好清水的培养皿、显微镜、载玻片、盖玻片、刀片等用具）。 （2）拿取材料进行切片，材料可以是新鲜的材料，也可以是经过固定的材料（切片时，将欲切材料断面和刀片上滴上清水以保持材料湿润