放射示踪及自显影分解.ppt

一、放射自显影技术的主要类型 （一）宏观自显影（macroautoradiography） 是指用肉眼或放大镜观察放射自显影图像形成的黑度强弱来判断放射性核素示踪部位及数量。这种自显影技术观察的范围较大，而分辨力较低。一般用于小动物的整体标本或大动物的脏器、肢体及各种色谱、电泳谱和免疫沉淀板等研究。 （1）整体动物切片自显影术（Whole body autoradiography)：是将给予示踪剂后的小动物制成切片，再按接触法进行曝光、显影、定影和水洗，常温下放干等处理后，得到该动物包括脏器在内的放射自显影像。 （2）脏器水平放射自显影术 在整体水平放射自显影基础上，如果需要把问题再深入一步，确定放射性核素是如何优势定位于肾脏组织的：是弥散性蓄积于肾脏，还是选择性定位于皮质、肾盂或髓质部位？要解决这个问题，用整体水平放射自显影观察，显然难以解决，因而需要进一步采用脏器水平的放射自显影术研究。 （3）色谱分析和电泳放射自显影 （4）双标记宏观彩色放射自显影 （二）光镜自显影术（light microscopic autoradiography)又称微观自显影，观察的范围较小，要凭借光学显微镜才能观察到，主要用于组织切片、细胞涂片、放射灰尘及离体组织受体与抗原定位等自显影。主要方法可有以下几种类型： １.血、骨髓涂片自显影术： ２.冰冻微观自显影术： ３.石蜡包埋微观自显影术： ４.荧光增敏微观放射自显影术： ５.双标记微观自显影术： 当需要研究机体同时摄入两种放射性示踪剂时掺入细胞的区别，必须采用双标记微观自显影术。该法主要依据两种示踪的放射性核素的辐射体类型不同、能量不同、半衰期不同，以及分布定位不同等特性建立的。 （三）电镜自显影术（electron microscopic autoradiography) 电子显微镜自显影术是将电子显微镜和放射自显影两种技术的各自优点加以综合利用的一种实验研究技术。目前已被用于细胞、亚细胞及生物大分子水平的放射性核素示踪研究。 １.电镜自显影的优缺点 主要优点是： （１）能够显示很微量的放射性物质在组织或细胞内及亚细胞水平的分布、定位，且有很高的分辨能力。 （２）能在不破坏细胞结构完整的情况下，研究某些大分子在生物合成过程中的精细定位，与生化技术相结合，成为分子生物学研究的新方法之一。 （３）对低能α及β粒子的测量是一种有效的方法。 主要缺点是： （１）电镜自显影的核乳胶很薄，最好是单层核乳胶，因此对高能β粒子的效率很差。 （２）需制备超薄切片，要使此片中获得足够的射线粒子，就需要使用较大量放射性示踪剂，这样可造成生物机体或细胞成分的辐射生物效应，从而改变了被研究对象的原有面貌。 （３）实验周期较长，由于乳胶层薄，切片薄，效率低，所含放射物质量少，故曝光过程一般较长。 ２.电镜自显影的制备方法 二、放射自显影的基本方法 （一）示踪剂的引入方法 示踪剂的引入方法要根据实验目的和要求而采用。一般采取以下方法： １.在体内实验中，采用静脉、肌肉、腹腔及灌胃途径引入体内。 ２.在体外实验中，如为培养的组织或细胞，则可直接加入培养瓶中；如为切片标本，则可直接加在切片标本上进行保温；如为神经解剖特殊示踪自显影，则可将示踪剂浓缩１００～２００倍后，用大脑立体定位仪直接注射到神经核团中；对有的不能通过血脑屏障的示踪剂，常用脑室或脑池注射。 （二）标本制备方法 放射自显影的标本制备方法因类型不同而异,根据刘鼎新等的经验，确立以下几种方法供选择： １.组织切片 一般制备的方法有两种，且各有优缺点，结合实验所需加以选择。 （１）冰冻切片：可采用恒温冰箱切片机，制备过程中标本可以不经任何溶液（包括固定液）。切片制成后不能解冰，应立即进行冷冻干燥。用这种方法制备的切片，示踪剂不会扩散、流失。制备过程时间较短，数小时内即可制备完毕。对于不会发生扩散或流失的短半衰期核素的实验，可将标本用适宜的固定液加以固定、水洗后，也可按此法制成冰冻切片（因制备过程时间较短），但这时不需冰冻干燥。冰冻切片的缺点是含脂肪多的组织不易涂敷液体乳胶，染色效果也较差。 （２）石蜡切片：用石蜡切片机在常温下制备切片。小型标本的制备约需２～3日。制备过程中标本必须经固定液固定、水洗、酒精脱水、二甲苯浸透、石蜡包埋等几道程序，示踪剂和某些组织成分（如脂肪）可能发生扩散、流失，故仅用于示踪剂不易发生扩散、流失的自显影实验。在制备石蜡切片过程中，常能洗去与机体组织成分未结合的游离示踪剂，使自显影的本底降低。石蜡切片组织清晰，染色良好，应在可能条件下，尽