关于透射电镜和扫描电镜等的样品制备程序.ppt

三、常规方法 1.取材：取材准确、体积不宜过大，以减少不必要的观察量。 2.固定：一般双固定，即戊二醛前固定，锇酸后固定。 3.清洗：生理盐水或缓冲液 4.系列乙醇脱水和醋酸异戊酯置换 5. 干燥：临界点干燥、空气干燥、冷冻干燥等 6.导电处理：离子溅射或真空喷镀 扫描电镜样品断裂面结构的观察 为了扩大扫描电镜的应用范围，越来越多的研究工作者采用不同的方法，用扫描电镜揭示组织块和细胞等样品断裂面的超微结构，得到的图像立体感强更加逼真，并且可与透射电镜的观察效果互补长短。 液氮冷冻割断法： 1.一般方法： A冷冻：把已干燥好的样品浸入液氮，或放在已经用液氮制冷的金属块上冷冻。 B割断：用双面刀片把样品切成两块。 C喷涂：把样品粘在样品台上，注意断裂面朝上，再真空喷金。 2.使用扫描电镜冷冻切割装置 附设在扫描电镜上的冷冻割断装置由冷冻剂罐、冷刀装置、预冷真空控制装置、样品台调节装置、温度控制装置和观察窗等组成。用这种装置，可连续地进行样品的冷冻、割断、喷涂和观察等一系列操作。程序如下： A冷冻：将样品安放在一个金属台支架上，用样品携带杆固定好后，迅速放入液氮冷冻（使用样品携带杆可以减少样品表面的结霜） B断裂：用样品携带杆把预冷的样品送入扫描电镜的冷冻割断小室中，用到断裂样品。（小室与冷冻剂罐相连，使样品台和刀都制冷） C喷涂：通过调节加热控制装置，使样品的断裂面升华，接着用喷金装置喷涂，这一步可以提高样品的导电性和图像的反差。 D观察：接着将样品送入扫描电镜的样品室，就可以观察了。 3. 树脂冷冻割断法这种方法容易掌握，应用也比较广泛。可选用多种树脂，如：EPON812等。在操作过程中共同的问题是，既要防止树脂聚合，又要使树脂固化，所以采用冷冻方法处理样品。具体步骤如下: A修样：取新鲜组织，切成1mm*1mm*5mm的棒状。 B固定和脱水:常规方法 C置换：将样品浸入氧化丙烷30min，在换氧化丙烷/树脂混合液浸数小时。 D包埋：医用2号胶囊中注满树脂（注意不含加速剂），在放入样品，9-12h。 E固化：－80度下固化，可用液氮或乙醚/干冰等冷冻剂。 F割断：用刀具等在木板态上槌打 。槌打时用力要适当，使断面平整 光洁犹如玻璃为佳。 G脱树脂：将割断的样品浸入氧化丙烯中处理2h，其间换3-5次新鲜的氧化丙烯，以彻底洗去样品中的树脂。 H按照常规方法临界点干燥和喷涂。 其它割断方法 1.苯乙烯树脂割断法： 这种方法的特点是操作简单，一方面包埋树脂要完全聚合，所以样品可保存较长时间；另一方面样品易被断裂，包埋的树脂也好溶解，所以应用比较广泛。特别对于较微小的样品，方向性较强的样品和用其它方法不易断裂的较硬的样品，如：结缔组织、软骨等更加适宜。 具体步骤如下： （1）修整样品，常规方法固定、脱水。 （2）置换：将样品浸入1：1乙醇/苯乙烯单体混合液中30min，在于-4度下用苯乙烯单体处理约12h。 （3）包埋：向苯乙烯单体中加入2％-3%的过氧化苯乙酰，充分搅拌均匀之后，注入 以放有样品的医用胶囊中，随机盖好。 （4）聚合：60度，24h以上。 （5）割断：先剥去胶囊，在用割断器操作。 （6）脱树脂：将割断的带有树脂的样品投入氧化丙烯中，约2h，期间换3-4次氧化丙烯。 （7）置换和干燥：用乙酸异戊酯处理20min以上，临界点干燥 游离细胞割断法： （1）固定：采用低浓度短时间的固定较好。如：1％戊二醛/0.1mol/l磷酸缓冲液，10-30min。 （2）离心：1000g，10min，离心成团，去上清液。 （3）加固：按体积1：1加入蛋清，搅拌均匀，使之成为蛋白/细胞混合液。 （4）后固定：用滴管缓缓加入戊二醛固定液，固定2h以上，直到蛋白从表面到底部都变硬，期间可换几次新鲜的固定液。 （5）修整：取出蛋白/细胞混合块，用双面刀片切成小条。 （6）割断：可选任意一种方法，操作同组织块一样。 超高压电镜样品的制备 超高压电镜电子束的波长更短，速度更快，穿透力比普通透射电镜要强得多。对于较厚的生物样品，亦能穿透，并且既能增加图像的立体感，又不影响图像的分辨力，所以可用超高压电镜观察比较厚的样品。但由于透射电镜的场深比较大，较厚的样品中各层次都会在焦使图像包含的内容过多，最终影响图像分析的质量。所以，超高压电镜在生物领域应用不十分广泛。只作简单介绍。 一、厚切片的制备 一、制备厚切片的原则 厚切片指1.5-3微米的厚切片。制备厚切片的过程与普通超薄切片相似，只是在某些步骤有一些特殊的要求。第一，样品块相对要软一些，以便连续切片和保护刀口；第二，要用较厚的支持膜，并喷碳加固，以防电子束的轰击；第三，可选用折叠式的单缝载网，以防止切片从载网上脱落；第四，最好用浸没法染色，且染色的时间可适当延长，以便使染液浸透样品。此外，在包