第5章降水反应.pptVIP

第五章　沉淀反应 (precipitation reaction); 指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现的沉淀现象。;形成肉眼可见的大的免疫复合物,反应慢。 沉淀线或沉淀环的观察以及免疫比浊法中的终点法就是测定此阶段形成的复合物　　;;多克隆抗体非常适用于免疫沉淀试验。 单克隆抗体 抗原表面只有一种表位，不易形成交联， 单克隆抗体一般不适用于免疫沉淀试验， 抗原表面有2个以上相同的表位，单克隆抗体也可用于免疫沉淀试验。 R型抗体：沉淀反应中多用。;环状沉淀试验 絮状沉淀试验;第一节　液相沉淀试验 （自学）;第二节　凝胶沉淀试验（gel phase precipitation）;原 理;;一、单向免疫扩散试验;（二）技术要点;抗体+琼脂;俯视图;抗体; 单向扩散试验结果 上排为5个不同浓度的参考品； 下排为患者血清。;1. Mancini曲线： 大分子抗原（IgM） 　时间扩散＞48h， 常数 C＝Kd2 普通坐标纸曲线 ;2. Fahey曲线： 小分子抗原（IgG,IgA） 扩散时间24h 　常数logC=kd 　半对数坐标纸曲线 ;（四）应用与评价; （一）原理： 将抗原抗体分别加在凝胶板不同的对应孔中，两者在凝胶中自由扩散，在比例合适处形成白色沉淀线。 ;抗体;（三）影响因素;（四）应用与评价; ;3.抗原或抗体的纯度鉴定;4.抗原、抗体的相对分子量和相对浓度的估计; ;5.抗原性质分析;操作简单，无需特殊设备。 特异性高，结果可靠，成本低廉。 灵敏度低，耗时长，不能精确定量。;优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 　　3.增加了分辨率。 　　　;原理： 双向扩散+电泳 在pH8.6的琼脂凝胶中， 抗原蛋白：等电点4～5，带较多的“-”，且分子较小，向正极的泳动速度大于向负极的电渗，抗原泳向正极； 抗体蛋白：等电点较高，带较少的负电荷，且分子较大，向正极的泳动速度小于向负极的电渗，抗体泳向负极。;通电;应用与评价;电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄，形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗原量呈正相关。 ;　　　　火箭免疫电泳图 ①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本;应用与评价;原理：区带电泳＋双向扩散 1、电泳：将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可见的若干区带 2、双扩：沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入相应抗血清进行双向扩散 。 ;+; ;应 用;四、自动化免疫电泳;第四节　免疫浊度测定;基本原理;根据检测器的位置及其所检测的光信号性质不同，免疫浊度测定分为： 免疫透射浊度测定（turbidimetry）：检测透射光强度 免疫散射浊度测定（nephelometry）：检测散射光强度 ;一、免疫透射浊度测定;（二）技术要点; （三）注意事项;（三）方法评价 ;1.粒子对光线的散射作用： 溶液中的微粒子受到光线照射后，微粒子对光线产生反射和折射而形成散射光。 悬浮微粒对光散射形成的散射光强度与微粒的大小、数量、入射光的波长和强度、测量角度等因素密切相关，其公式如下：;Iθ：与入射光成θ角处散射光强度； λ和I0：为入射光的波长和强度； dn/dc为校正因子，反映了溶液折射指数和颗粒浓度的变化； M为颗粒分子量； c为浓度； N为阿佛加德指数；γ为颗粒到检测器的距离； θ为散射光与入射光的夹角（散射夹角）。;Rayleigh散射：当粒径小于入射光波长的1/10时，散射光强度在各个方向的分布均匀一致 Debye散射：当粒径大于入射光波长的1/10或接近入射光波长时，散射光呈明显的不均匀分布，向前散射光大于向后散射光 Mie散射：当粒径等于或大于入射光波长时，向前散射光远远大于向后散射光。;2.免疫散射浊度测定对抗原定量的原理;1.终点散射比浊法 (end-point nephelometry)　 2.固定时间散射比浊法 （fixed time ephelometry） 3.速率散射比浊法（rate nephelometry）;原理：在抗原抗体反应达到平衡时测定散射光强度。必须在免疫复合物相互聚合形成絮状沉淀之前进行浊度测定，以免光散射值降低，得出偏低的结果。;反应时间较速率法稍长； 可自动化； 计算时需要减去本底值； 检测限达微克水平（μg/L），但低于速率散射比浊法。;原理：在保证抗体过量的情况下，加入待测抗原，此时反应立即开始，在反应的第一阶段，溶液中产生的散射光信号波动较大，所获取的信号计算出的结果会产生一定的误差。定时散射比浊法是避开抗原抗体反应的不稳定