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技术指南 第五部分 染色质免疫沉淀 （ Chromatine Immunoprecipitation, ChIP）：用于研究体内蛋白质与DNA 相互作用的有效方法，用它可以定性研究蛋白质与基因组中特定区域的相互作用。它涉及 蛋白质/DNA复合物的交联固定和蛋白质/DNA 的免疫共沉淀。首先用甲醛溶液将完整的细胞 固定，甲醛的交联作用可保护蛋白质/DNA 的相互作用，然后利用超声波将DNA破碎成一定 大小的小片段，用目标DNA结合蛋白抗体与DNA/蛋白质复合物进行免疫共沉淀反应。随后 进行去交联作用，再用蛋白酶K除去蛋白质，利用DNA纯化柱对DNA进行快速纯化。然后将 结合靶蛋白上的基因/序列筛查出来。可用普通的杂交实验（Southern印迹：一种非常相似 于Northern印迹技术，但检测的是DNA而非RNA，见技术指南第三部分）或多重靶向PCR 方法（可使用特定寡聚物扩增靶序列；如果该序列目在于ChIP样本中，即可得到PCR产物） 来进行筛查。 （因版权问题，此处图片被删除） GST/谷胱甘肽与His-tag/Niquel-NTA 清除试验：用于检测蛋白质相互作用。用GST （“谷 胱甘肽S 转移酶”）标记一种蛋白（‘诱饵’蛋白），使之对谷胱甘肽具有高亲和力，将该蛋 白的DNA 克隆入质粒，产生GST 融合蛋白，以完成GST 标记。 通常在大肠杆菌中表达GST 融合蛋白。在谷胱甘肽交联琼脂糖（“GST-珠”，它们将结合目 标蛋白）上孵育细菌裂解液，从中分离诱饵蛋白。过量谷胱甘肽缓冲液洗脱后，用纯化的 诱饵蛋白做体外结合测试（称GST-清除）检测蛋白质-蛋白质相互作用。将诱饵蛋白置入另 一细菌裂解液（来自原始组织的细胞，两种蛋白— ‘诱饵’和‘靶’蛋白—实际均来自此 细胞）。向提取物中再次加入 GST-珠并进行沉淀分离，只有与 GST 融合蛋白（‘诱饵’蛋 白）相互作用的蛋白被沉淀。随后用SDS和Western 印迹分析所有样本（可用特异 性抗体或抗标签抗体，如-HA、-myc 等标签的抗体，检测清除组分中靶蛋白的存在）。有时 可利用包含靶蛋白的全部细菌裂解液样本作为阳性对照（显示靶蛋白的确存在于提取物 中）。也可另外加入纯化的诱饵蛋白作为阳性对照，通常称为‘输入’或‘总计’。实验时 将细菌裂解液单独与 GST-beads （无诱饵蛋白）混合，如果不能见到靶蛋白被清除下来， 则该结果为阴性对照。最终，可见靶蛋白通过有 GST 融合蛋白或诱饵蛋白的 GST-珠从细 菌裂解液“清除下来”（显示蛋白质有相互作用，即一个蛋白能把另一个蛋白“拉”下来）。 此试验的另一种改良方法是用组氨酸六聚体代替GST 标记诱饵蛋白并使用镍珠 （Ni2+-NTA ），其余步骤与上述基本相同。Ni2+-NTA珠为用金属镍螯合氮川乙酸(NTA)的琼 脂糖磁珠，固定在NTA上的Ni2+可与组氨酸六聚体标记的蛋白高度特异性结合。用磁性装置 分离磁珠，改变缓冲液冲洗或洗脱组氨酸六聚体标记的蛋白，而磁珠则由于磁场的作用留 在容器/试管一边。 ‘pull- down’ 技术简图 （因版权问题，此处图片被删除） 不同类型的磁性装置 （因版权问题，此处图片被删除） α-鹅膏蕈碱：α-鹅膏蕈碱为Amanita phalloides(毒鹅膏，有致死菌伞)、A.verna(致命天使)、 A.virosa 、A.ocreata 、A.tenuifolia 以及其它鹅膏属剧毒蕈类（当心这些蘑菇！）的主要毒素。 α-鹅膏蕈碱直接抑制RNA 聚合酶II （进而干扰mRNA 合成）。蛋白合成停止和细胞坏死最 终导致急性重型肝炎（和其它中毒症状）。 （因版权问题，此处图片被删除） 顺铂：通常认为顺铂可通过与DNA结合并干扰其修复机制最终导致细胞死亡的机制来杀死 肿瘤细胞。该过程的第一步（顺铂分子完整透过细胞膜后）是以一分子水置换顺铂分子的 一个氯离子，顺铂置换后的结构可与DNA核苷酸上一个单独的氮原子结合，接着第二个氯 离子被另一水分子置换