知识(课用)肝糖原的提取与.pptVIP

实验四肝糖原的提取与鉴定 刘曼 TELE-mail：manna_liu@126.com * 实验报告问题： 字如其人 结果无分析 照抄 * 糖原的结构特点 糖原是一种高分子化合物(分子量约为400万)。微溶于水，无还原性，与碘作用生成红色。 1. 葡萄糖单元以α-1,4-糖苷 键形成长链。 2. 约10个葡萄糖单元处形成分枝，分枝处葡萄糖以α-1,6-糖苷键连接，分支增加，溶解度增加。 * * 实验原理 肝糖原是糖在体内的重要储存形式之一，储存量虽然不多，但在代谢过程中，它是维持血糖平衡及体内糖的重要来源之一，其合成或分解，对血糖浓度的调节起着重要的作用。 * 肝脏 蛋白质(沉淀) 糖原(上清) 糖原沉淀 与碘液反应 斑氏试剂 三氯乙酸 95%乙醇，离心 HCl水解 加H2O溶解 肝糖原：棕红色 砖红色沉淀 * 实验试剂 10％（w/v）三氯乙酸溶液 1 ５％（w/v）三氯乙酸溶液 2 95％（v /v）乙醇 3 浓盐酸 4 * 实验试剂 20%（w/v）NaOH溶液 1 碘液 2 斑氏试剂 3 * 实验器材 洗净的石英砂 1 研钵 2 离心机 3 电磁炉 4 * 实验步骤一、肝糖原的提取 1 称取肝组织2g（两个组用），置研钵中。加入洗净的石英砂少许及10％三氯醋酸2ml，然后研磨。 2 再加5％三氯乙酸4ml，继续研磨，至肝脏组织已充分磨成肉糜状为止。然后以2500r／min离心10min。 3 将上清液转入另一离心管中，测量其体积。 * 4 加入等体积的95％乙醇。混匀后，静置10min，此时可见糖原呈絮状析出。 5 将此混合物以2500r／min离心10min。弃去上清液，并将离心管倒置于滤纸上1～2min。 6 向沉淀内加入蒸馏水2ml，再用玻璃棒搅拌沉淀至溶解，即得糖原溶液。（分两份） * 实验步骤二、肝糖原的鉴定 1 糖原的颜色反应：在白瓷盘的两个凹槽内，一个滴加3滴肝糖原溶液，一个滴加3滴蒸馏水。 2 在两个凹槽内各加1滴I2-KI溶液，在桌面上来回晃动白瓷盘。 3 比较两凹槽内溶液颜色有何不同，并解释之。 * 2 取出冷却，然后以20％NaOH溶液中和至中性(用pH试纸检验，加入约3滴)。 3 在上述溶液内，加入斑氏试剂2ml。再将该试管置沸水浴加热5min，取出冷却。观察沉淀的生成，并解释之。 1 肝糖原水解实验：将剩余的糖原溶液转入1支试管内，加入浓盐酸3滴后，将之放在沸水浴中加热10 min。 * 注意事项 取肝脏组织时，吸去其附着血液，因血液可能含还原性葡萄糖，会影响后面糖原的鉴定。 研磨应充分，使细胞破裂，肝糖原释放出来。研磨不充分会得不到糖原或含量很少，影响后面的鉴定。 研磨后匀浆转入离心管离心可用滴管转移，如果采用倒入，不能洒落管外，应尽量转移干净。 离心时与另一组的离心管平衡，对称放入离心机。 上清液加入95％乙醇后，注意混匀，防止分层，可用滴管吹吸混匀，或玻璃棒搅拌混匀。 调节pH，必须调至中性。 * 糖原会在浓盐酸在沸水浴下分解成小分子化合物，其中有还原性的麦芽糖和葡萄糖。还原性糖会在碱性条件下，班氏试剂与其在沸水浴下生成砖红色Co2O沉淀。 班氏试剂为碱性溶液，所以须用20%NaOH溶液中和至中性。过酸，Cu2+会变得较为稳定，不容易发生反应，所以不能进行试验。 如果溶液中还原糖含量较低，产生的氧化亚铜便会相应减少，因此试验后可能只会出现绿色、混浊的黄色或橙色沉淀物。 班氏试剂中有CuSO4，NaCO3和柠檬酸钠。CO32-提供碱性环境，柠檬酸钠为络合物，帮助Cu2+与葡萄糖反应，沸水浴下，Cu2+变为Cu+，即Cu2O，Cu2O为砖红色沉淀。葡萄糖被氧化为糖酸，麦芽糖亦如此。 * 糖原储存于细胞内，采用研磨匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使糖原与蛋白质等其它成分分离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95％乙醇将滤液中糖原沉淀，再溶于热水中。 糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反应和葡萄糖的还原性，可判定肝组织中糖原的存在。 CuSO4十2NaOH ═ Na2 SO4+Cu(OH)2↓ 2Cu(OH)2十C6H12O6 ═ 2CuOH十氧化型葡萄糖+H2O 2CuOH ═ Cu2O↓(红色)+H2O Cu(OH)2 ═ CuO↓(黑色)+H2O * 提取糖原时，首先将新鲜的肝组织与石英砂及三氯乙酸共同研磨。这样当肝组织被充分破碎后，其中的蛋白质会被三氯乙酸所沉淀。而糖原仍留在溶液中。然后离心除去沉淀，滤液中的肝糖原可通过加入乙醇而沉淀下来