第2章微 生物的纯培养与显微技术.ppt

第三章　微生物的纯培养和显微技术 A：研究微生物的途径：（群体） 培养物：在微生物学中，在人为规定的条件下培养，繁殖得到的微生物群体。 纯培养物：只有一种微生物的培养物。（利于研究、应用、重复结果） B：利用显微技术进行研究 　显微技术包括显微标本的制作、观察、测定、分析及记录等方面的内容。 第一节　微生物的分离和纯培养 无菌技术 用固体培养基分离纯培养 用液体培养基分离纯培养 单细胞（单孢子）分离 选择培养分离 一、无菌技术 无菌技术：在分离、转接及培养纯培养(物)时防止其被其他微生物污染的技术。 保持无菌的方法 高压蒸气灭菌 高温干热灭菌 棉塞 超净工作台等 二、用固体培养基分离纯培养 菌落：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。 菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。 菌落 菌落或菌苔是对微生物进行分类和鉴定的重要依据。 菌落 培养平板 培养平板（平板）：指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛有固体培养基的平皿。 平板分离微生物纯培养技术 稀释倒平板法 涂布平板法 平板划线分离法 稀释摇管法 1、稀释倒平板法： 无菌水、梯度稀释、50℃左右的琼脂培养基、灭过菌的培养皿。注意要稀释得当。 分离出单个菌落以后，重复上述操作数次，便可得到纯培养。 Pour plate 涂布平板法 稀释倒平板法和涂布平板法 平板划线分离法 稀释摇管法 用于分离严格厌氧菌。先将一系列盛有无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基与空气隔开。 三、用液体培养基分离纯培养 用于细胞大的细菌、原生动物和藻类等的纯化分离。 稀释法：经高度稀释后，同一个稀释度的试管中大多数（95%以上）表现不生长，很可能得到的是纯培养。 四、单细胞（单孢子）分离 单细胞分离：采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。 单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比。个体较大的可在低倍显微镜下进行，个体较小的则需采用显微操作仪。 五、选择培养分离 当某一种微生物所存在的数量与其他微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释方法几乎是不可能分离到该种微生物的，故需采用选择培养分离法。 1、利用选择培养基进行直接分离 如要分离高温菌，可在高温条件进行培养；要分离某种抗生素抗性菌株，可在加有抗生素的平板上进行分离。 2、富集培养 主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。 富集条件：物理、化学和生物等。以从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验为例。 六、微生物的保藏技术 保藏期间微生物不死亡、不污染、不会因发生而丢失重要的生物学性状。 许多国家都设有相应的菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会 美国典型菌种保藏中心 世界菌种保藏联合会等 菌种保藏 菌种保藏：就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。 菌种保藏方法 连续移接 改变条件（干燥、低温、缺氧、缺乏营养等）使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保藏，有的可保藏几十年或更长的时间。 在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力。 1、传代培养保藏 是微生物保存的基本方法。 琼脂斜面、半固体琼脂柱和液体培养等。 橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温保存。 4℃保存。 2、冷冻保藏 代谢作用停止。 细胞体积大者要比小者对低温更敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁敏感。其原因是低温会使细胞内水分形成冰晶，从而引起细胞，尤其是细胞膜的损伤。 速冻及快速解冻可减少损伤；还可加一些保护剂，如0.5%左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞，并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞； 大分子物质因此在采用冷冻法保藏菌种时，一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。 3、干燥保藏法 沙土管保存和冷冻真空干燥保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。 沙土管保存 一般将菌种接种至斜面，培养至长出大量的孢子后，洗下孢子制备孢子悬浮液，加入无菌沙土试管中，减压干燥，直至将水分抽干，最后用石蜡、橡胶塞等封闭管口，置冰箱保存。此法主要适用于产孢子的微生物，如芽孢杆菌、放线菌等，保藏时间相对较长。 冷冻真空干燥保藏 是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻，使其冻结，然后在真空下通过水的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在