大黄鱼类Ⅳ型抗冻蛋白基因的克隆、表达和功能研究.pdfVIP

食品与药品 FoodandDrug 2009年第 11卷第O9期 大黄鱼类lV型抗冻蛋白基因的克隆、表达及功能研究 张 晓，吴海珍 ，卫 玮，徐红艳，张元兴 (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237) 摘 要：目的 研究大黄鱼类Iv型抗冻蛋白基因编码产物的功能。方法 从大黄鱼肝脏 SSHeDNA文库筛选到的类似极地 鱼类Iv型抗冻蛋白的EST序列出发，用RACE方法克隆Iv型抗冻蛋白基因全长cDNA，RT-PCR分析此基因在大黄鱼不同组 织内的表达。构建原核表达载体pGEX一4T-Lycafp并表达蛋白质，亲和层析纯化GST融合蛋白，分析它的体外细菌抗冻保护 作用。结果大黄鱼类IV型抗冻蛋白基因cDNA全长664bp，包含372bp开放阅读框，编码124个氨基酸，经SignalP3．0软件 预测其N端前20位氨基酸为信号肽，氨基酸序列与长角杜夫鱼Iv型抗冻蛋白同源性高达52％；RT-PCR分析表明其mRNA 仅在肝脏表达；重组蛋 白在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达，初步纯化后分析体外细菌抗冻保护作用表明，融合蛋 白 抗冻活性并不明显。结论 大黄鱼类Iv型抗冻蛋 白不具有显著的抗冻活性，这与大黄鱼不能在低温下生存吻合。 关键词：鱼类IV型抗冻蛋 白；AR CE：抗冻活性：大黄鱼 中图分类号：11973 文献标识码：A 文章编号：1672—979X (2009)09．0015．05 Cloning，ExpressionandCharacterizationofAntifreezeProteinIV-likeGene fromLargeYellowCroaker(PseudosciaenaCrocea) ZHANGXiao，、 Hai-zhenWEIWei，XU Hong-yan,ZI-I GYuan-xing ， (StateKeyLabofBioreaetorEngineering,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237，China) Abstract：ObjectiveToinvestigatethefunctionofantifreezeprotein(AFP)IV-likegenerfom largeyellow croaker．M ethods TheESTrfagmentwhichwassimilartothepolarfishAFPIV genewasscreenedrfom the largeyellow croakerliverSSH cDNA library．ThecompletecDNA oflargeyellow croakerAFPIV-likegenewas clonedbytheRACEmethod．ThetissueexpressionpaRernoftheAFPIV-likegenewasanalyzedbyRT-PCR．The prokaryoticexpressionvectorpGEX一4T-LycafpwasexpressedandGSTfusionproteinwaspurifiedbytheaffinity chromatography．TheantirfeezeprotectionofGSTufsionproteintobacteriawasdetectedinvitro．ResultsThe completecDNA contained664basepairs，includinga372bpopenreadingrfamewhichcodesfora124-residue largeyellow croakerAFPIV-likeproteinprecursor．The20一aminoacidsequenceofN terminalproteincouldbea signalpeptidewithSignalP3．0server．Thededucedaminoacidsequencewashighlyhomologoustolonghornsculpin AFPIV-likegenewith52 ％ identity．RT-PCR revealedthatthemRNA wasexpre