13例Menkes病患者ATP7A基因突变概述.docVIP

　　13例Menkes病患者ATP7A基因突变概述 前言 自1987年报道3例女性病例后[3][4]提示本病代谢异常方式可能为性连锁，之后于1993年定义为X连锁性疾病[5]。多数研究认为，Menkes基因位于Xq13.2-13.3，该基因产物是1500个氨基酸的P型ATP酶 (ATP7A)。临床表现以进行性神经系统的变性和结缔组织的异常为特点，临床特征主要包括早期癫痫发作、头发卷曲打结、特殊面容、肤色白皙、皮肤松弛、生长发育迟缓、精神发育迟滞及代谢异常等，经典型患儿大多数在3岁前死亡。国外曾经报道MD的发病率约为1／300000活产婴儿[6]，日本为1/360000[7]。目前国内还没有这方面的流行病学的资料，仅有极少个例或家系的报道[8-11]。近50年的不断研究，已经对Menkes病的临床、诊断、生物化学及遗传学等方面有了一定的进展，但仍然有许多问题需要进一步深入探索。至2013年8月25日，国际ATP7A基因数据库中报道的突变一共有510种，其中点突变291种，缺失突变142种，重复突变37种，插入突变8种，插入/缺失2种，染色体易位2种，未知分型的28种。近年国内开展了关于Menkes病ATP7A基因突变的研究，明确了部分家系的突变位点。我们采用聚合酶链式反应（PCR）和 DNA直接测序以及多重连接依赖式探针扩增技术，对2006年到2013年就诊于北京大学第一医院儿科的13例Menkes病患儿家系进行了ATP7A基因突变的分析，从基因方面进行了确诊，探讨其基因型和表型之间的相关性，明确这些家系的突变位点，了解我国的ATP7A基因的突变谱，总结我国ATP7A基因的突变热点，这将有利于我国快速开展ATP7A基因突变的检测，为Menkes病患者及家属进一步的遗传咨询和产前诊断奠定基础。 1.实验材料及耗材 1.1实验材料和分子生物学试剂 本实验采用盐析法提取 DNA,所需试剂及具体的配制方法如下10%Triton 配制将 Triton 原液（X-100）（购于 Sigma 公司）稀释 10 倍，取 50ml 离心管，将 5ml 的 Triton 原液及 45ml 的高压之后的去离子水倒于该管中充分混匀，常温保存。PK 配制PK 粉加 10ml 高压后去离子水稀释并充分摇匀，至 PK 粉彻底溶解之后分装入 10 个 1.5ml 的 EP 管中，负 20 度保存。DNA 提取液配制（400ML）0.5M 的 EDTANa2（pH8.0）： 8ml1M 的 Tris.Hcl（pH8.0） ： 4ml6M 的 Nacl： 0.66ml将上述三种试剂按量分别加入到 500ml 容器中后再加去离子水387.34ml，充分混匀，放入高压锅中高压灭菌，分装，室温保存。6M Nacl 配制（500ml）称 175.32g NaCl（购于北京市化学试剂公司）置于 500ml 容器内，加入去离子水至 500 ml，搅拌溶解，配好后放入高压锅进行高压灭菌，分装，室温保存。10% (g 离子的 10PCR 缓冲液 2.5mu; l （上海英俊生物技术有限公司） 10 mmol/L dNTP 混合液 0.5mu; l （上海英俊生物技术有限公司） 50 mmol/L MgCl20.75mu; l （上海英俊生物技术有限公司） 10 ng/mu; l 正、反向引物 各 1mu; （l北京天一辉远生物科技有限公司） Platinum Taq DNA 聚合酶 0.1mu; l （上海英俊生物技术有限公司） 100ng/ul 的模板 DNA 1.5mu; l灭菌蒸馏水 补加到 25mu; l 2.2 纳入标准 Menkes 病是由于 ATP7A 基因突变导致的罕见的先天性铜转运障碍性疾病，遗传方式为 X-连锁隐性遗传。目前诊断主要依据临床表现和影像学检查对其进行临床的初步诊断，然后再通过基因检测来确诊。以下为 Menkes 病的初步入选标准，本实验组的所有病例均为基因确诊阳性者。Menkes 病的初步入选标准如下： 1） 临床上绝大多数发病者都为男性，也有极少数的女孩发病； 2） 患儿一般在出生后几周内神经系统发育状况和同龄儿相似，典型病例多在 2-3 个月月龄时出现精神运动发育的倒退、癫痫发作、躯干肌张力减低、生长迟缓及喂养困难等； 3） 特殊面容：下腭宽厚、鼻梁低、两颊下榻； 4） 典型的毛发改变：色浅发黄、干枯稀疏、扭曲打结、质脆易断，主要以枕后及两侧颞部为主，显微镜下可以见到毛发念珠状及空管样的改变； 5） 还可有皮肤松垂、漏斗状胸、腹股沟疝或者脐疝、关节韧带松弛、膀胱憩室、血管迂曲等； 6） 血清铜及血浆铜蓝蛋白的减低； 7） MRA 示：血管迂曲，可见螺丝锥样改变； 8） MRI 示：脑白质发育落后、脑白质异常及硬膜下积液等表现。 . 3 结果.