狂犬病实验室检测技术指南.PDFVIP

附件2 狂犬病实验室检测技术指南 1、实验室条件及生物安全操作要求 （1） 从事狂犬病临床和实验室的工作人员需要暴露前免疫，所有意外暴露于 狂犬病毒时必需立即报告本部门负责人。 （2 ） 操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2 或P3 （实验室固定毒在P2 ， 病人或动物分离的街毒在P3 ）生物安全实验室内进行。 （3 ） 当实验室对接收到的动物标本进行操作时，必须在P3 以上条件的专业实 验室中进行。没有安全实验室（P3 级）的单位，严禁从事病毒分离工作。 （4 ） 实验前要穿戴好防护服装、眼镜、手套，作好技术上的准备。 （5 ） 由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作应在密闭状 态下进行。 （6 ） 实验后要作好善后消毒处理,狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯仿、丙 酮），45～70% 乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对操作台、实验 材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。 2、实验室检测网络组成及职责 （1） 中国疾病预防控制中心牵头，全国各省级疾病预防控制中心及所辖区域内的各 级疾病预防控制中心组成实验室检测网络。 （2 ） 中国疾病预防控制中心职责 A. 诊断试剂的研制、标准化，并推荐质量稳定可靠的诊断试剂； B. 负责毒株的鉴定和病毒变异性调查； C. 对各级实验室检测人员进行技术培训。 D. 协助省级疾病预防控制中心完成标本的实验室检测。 （3 ） 省级疾病预防控制中心职责 A. 收集、保存辖区内各监测点的各种待检测标本。 B. 辖区内各种标本的实验室检测。 C. 对本省监测点标本采集和运送给与技术指导和协助。 （4 ） 县级监测点疾病预防控制中心职责 采集病例标本，运送病例标本至省级疾病预防控制中心。 3、实验室检测方法 1 （1）病原检测： A. 免疫荧光法检测抗原：病人的脑脊髓液或唾液直接涂片、病人的角膜印片或咬 伤部位皮肤组织或脑组织印片或冷冻切片，丙酮固定，抗狂犬病毒特异性荧光 抗体染色检测狂犬病毒抗原。 B. 快速狂犬病酶联免疫吸附法检测抗原：用pH 9.6 的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬 病毒核衣壳IgG 包被96 孔酶标板，4 ℃过夜；用含0.3 ％牛血清白蛋白和5% 蔗 糖的pH9.6 碳酸盐缓冲液封闭30 分钟；将采集到的标本研磨，用pH 7.4 PBS 制成30 ％的悬液，离心取上清加入酶标板孔内，同时设阴性、阳性对照，200 µ l/孔，37℃孵育1 小时；洗板四次后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200 μl/ 孔，37℃ l 小时后洗板，加入酶反应底物，室温作用30 分钟，2M H SO 终止 2 4 反应，肉眼观察或酶标仪测定结果。 （2 ）核酸检测： RT-PCR 方法：以特异性扩增核蛋白（N ）基因最保守区域为目的基因，设计一对 引物：N1 （＋）：5’-587TTT GAG ACT GCT CCT TTT G605-3’; N2 （- ）：5’-1092CC CAT ATA GCA TCC TAC605-3 。唾液、脑脊液、皮肤或脑组织标本以及感染病毒后的细胞培养物 或鼠脑均可用于病毒核酸的检测。基本步骤为：待检标本用细胞总RNA 分离试剂提取 病毒RNA ，再通过逆转录反应合成与目的基因RNA 序列互补的cDNA，PCR 循环特 异性扩增目的基因cDNA，电泳检测PCR 扩增产物，判断检测结果。 （3 ）病毒分离：抗原或核酸检测阳性标本可以进行病毒分离以便进行更深入的研究。 A. 细胞培养法分离病毒：将唾液、脑脊液、皮肤或脑组织标本研磨后，用PBS 或 MEM 制成3