MTT法用于测定细胞增殖.doc

MTT实验法测定细胞增殖 1.实验材料 1.1. 实验细胞株 癌细胞株用含有10%新生小牛灭活血清RPMI-1640培养基，培养在37℃、饱和湿度、5%CO2的无菌培养箱中，每隔2～3天进行一次细胞传代。 1.2 药物与试剂 RPMI-1640 培养基 DMSO 胰蛋白酶粉 1-甲基乙内酰脲 5-氟尿嘧啶 MTT 粉 甘油 碘化丙啶(PI) 新生小牛血清 1.3 仪器设备 超净工作台（SW-CJ-2FD 型） 超低温电冰箱 恒温水浴箱 低温高速离心机 恒温震荡摇动床 -20℃电冰箱 光学显微镜 电子天平 Eppendorf 移液枪（10、100、1000ul） 去离子纯水仪 流式细胞仪 低温数控高速离心机 普通离心机 1.4 主要试剂配方 1.4.1 PBS 溶液 磷酸二氢钾(KH2PO4)0.24g、氯化钠(NaCl)8.0g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.44g、氯化钾(KCl)0.2g，用去离子水(ddH2O)溶解，然后将其定容使总体积为 1.0L。再使用盐酸将 PH 值调至 7.4，用无菌盐水瓶分装好，高压消毒灭菌，4℃内保存。临用前要在 37℃水浴加热。 1.4.2 细胞培养基 称取 RIPM-1640 培养基粉 10.4g，用 1.0L ddH2O 溶解，再往溶液中加入 2g NaHCO3，再用盐酸将 PH 值调整至 7.0，采用抽滤法除菌，无菌盐水瓶分装，置于 4℃冰箱中保存，使用前往瓶中加入灭活新生小牛血清，使每瓶培养基中灭活新生小牛血清的浓度为 10%。每次临用前要将含有 10%灭活新生小牛血清的RPMI-1640 培养基置于 37℃水浴箱中加热。 1.4.3 新生小牛血清 临用前，将新生小牛血清置于 56℃水浴中灭活 30min，之后用无菌盐水瓶分装密封，再置于-20℃冰箱中保存。 1.4.4 胰蛋白酶 在 100ml 的 PBS 溶液中加入胰蛋白酶粉 0.25g，置于 4℃冰箱中过夜，用直径为 0.22μm 微孔滤膜除菌器除菌后分装、密封，置于 4℃冰箱中保存。 1.4.5 MTT 溶液(5mg/ml) 往 50ml 无菌 PBS 中加入 250mg MTT 粉，轻轻摇匀，使 MTT 粉充分溶解，予用直径为 0.22μm 微孔滤膜除菌后分装、密封，锡箔纸避光，置于 4℃冰箱中临时保存（≤7 天），置于-20℃冰箱中短期保存（≤1 月）。 1.4.6 4%多聚甲醛 称取多聚甲醛 4g 溶于 50ml 蒸馏水中，然后加热至 70℃左右，用玻璃棒搅拌溶液使多聚甲醛充分溶解，然后往溶液中逐滴加入浓度为 1mol/L 的 Na0H 至溶液澄清，冷却，蒸馏水定容至 100ml，用盐酸将 PH 调至 7.2，锡箔纸避光，置于 4℃冰箱中保存。 1.4.7 苏木精染液 蒸馏水 700ml，甘油 300ml，苏木精 5g，碘酸钠 0.5g，冰醋酸 20ml，硫酸铝钾 500g。 1.4.8 伊红染液 蒸馏水 100ml，伊红 0.5g，氯化钙 0.5g。 1.4.9 1-甲基乙内酰脲溶液的配制 1-甲基乙内酰脲（M）分子式为 C4H6N2O2，分子量为 114.10，纯度99.0%，吸取适量该药物，加入少量 PBS 或生理盐水（PH7.4），配制成 500 mg·L-1的母液。-20℃保存，临用时稀释。 1.4.10 5-Fu 溶液的配制 5- 氟尿嘧啶（ 5-Fu ）分子量为 130.08 ，分子式为 C4H3FN2O2，规格为250mg/10ml，pH 值为 8.4～9.2，吸取适量该药物，加入少量 PBS 或生理盐水（PH7.4），配置成 100mgL的母液。-20℃保存，临用时稀释。 2.实验方法. 2.1.细胞培养 2.1.1.细胞复苏 (1)从-80℃冰箱迅速取出冻存人结肠癌 SW480 细胞的冻存管，然后迅速投入37℃水浴箱中，轻轻摇动冻存管，使冻存管内容物迅速融化，取出后用 75%酒精消毒，放入无菌操作台，在操作台中开启冻存管。用 1000ul 的移液枪吸出溶解的细胞悬液，注入离心管，同时往离心管中加入 10 倍 10%灭活新生小牛血清RPMI-1640 培养基，准备离心。 (2) 室温下，1000 rpm，离心 5min，用移液枪吸取离心管中上清液、弃去，然后用细胞培养液洗 1～2 次，弃去上清培养液后，加入 1ml 培养液，用吹打管轻轻吹打，使离心管底部的细胞悬于培养基中，形成悬浮液。 (3)用培养液适当稀释悬浮液后，用移液枪将细胞悬液接种到 1