凝胶过滤色谱分类.ppt

凝胶过滤层析（分子筛层析、排阻层析）;;;凝胶层析的原理：利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。;;1.总床体积： Vt =Vo+Vi+Vg 2.某一成分从层析柱内完全被洗脱出来所需洗脱液的体积 ： Ve=Vo+KdVi ; 分配系数： Kd=(Ve-Vo)/Vi Kd=0：说明该物质完全分布于流动相，固定相分布为零。(分子很大，不进入凝胶网孔） Kd=1：表示该种物质能均等地分布在流动相，在两相间分配的比值为1。（分子极小，可自由通过网孔进出凝胶） 0Kd1：分子大小处于这两个极端之间，它的洗脱体积应在V0到V0+Vi之间；另一方面，相对分子质量与洗脱体积有关，所以在有适当的已知相对分子量的物质作为标准进行比较的条件下，就可以根据洗脱液的体积来估计物质的相对分子量。 ;;优点： a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用 凝胶的类型： （1）Sephadex: 交联葡聚糖 G-10，15，25，50，75，100，150，200 商品凝胶的型号，用吸水量的10倍数字表示（比如：每克干凝胶吸水量为2.5克时，其型号为G-25） （2）Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A （3）Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 （4）Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶 ;凝胶及柱的选择 ; ;样品上柱 洗脱收集 部分收集器、核酸蛋白检测仪 （蛋白质在280nm处的光吸 收值与其浓度成正比） 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰 ;应用 a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 浓缩 c. 蛋白质分子量的测定;1. 柱要保持垂直。 2. 液面要高于胶面。 3．?要根据所需纯化物质的分子量选择胶的孔径。本实验用G-50。 4． 胶要充分膨胀，并去掉小颗粒。 5．?装柱要均一，胶面要平整，柱不能留有气泡（包括死空间），必要时可用玻棒在凝胶表面轻轻搅拌，再让凝胶自然沉淀。胶柱不能有断层。否则得重装。;6．? 装完后上样前要用洗脱液平衡。 7．?要稳压，控制洗脱液排出口与洗脱瓶之间的高度差，并控制洗脱速度，速度为6—7滴/分钟。 8．? 使用过的柱用2倍洗脱液平衡后可再上柱使用。 9. 上样时，缓慢沿层析柱内壁加于柱床表面。