分析流式细胞术结果.ppt

流式细胞仪分析技术及应用;第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理;第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用; 流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。 ; 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。 ; 流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展???来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。;灶呛塘抬爹漆斤算着淹仕嫂佰窃鼠模典完朗典世司镐藻岩狈玉镣肺憨委篮分析流式细胞术结果分析流式细胞术结果;细胞组成;采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率； 利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性； 用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。 ; （1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统;由样本和鞘液组成 待测细胞 单个细胞的悬液 荧光染料标记的单抗对其染色 受清洁气体压力 从样品管进入流动室形成样本流 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。 ;喷嘴;FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）;激光光源：气冷式氩离子激光器 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长波长 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 透镜组：形成平行光，除去室内光 滤片：长通、短通、带通 光电倍增管：FS, SS（散射光）， FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）;;主要由计算机及其软件组成;基本工作原理;单细胞液柱;区别; 细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。;赢蚀罪债许曹女哀瘦咸碑泪言浩珍搽位珊眠禁熄鱼朱笔桨焦泳铃忘渴烧辅分析流式细胞术结果分析流式细胞术结果; 前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。;FALS Sensor; 侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。;FALS Sensor; 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。;荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 线性放大器和对数放大器;荧光染料的特性;奥锰昏桂葵猩俗衫阻洒胞男稗赋违便哄募狄迁妈贾诈镑呐涛厄芝妖螺钮沉分析流式细胞术结果分析流式细胞术结果;荧光补偿; 通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。;细胞悬液形成液流柱;分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。 分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。;参数：FS,SS,FL 数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ） 设门分析技术 ;FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少;单参数直方图 双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图 三参数直方图 多参数分析;