斑马鱼几种CYP基因在性腺不同发育阶段表达研究.docVIP

　　斑马鱼几种CYP基因在性腺不同发育阶段表达研究 1 绪论 1.1细胞色素 P450 研究进展 细胞色素 P450（CYP450）蛋白酶超家族是一类血红蛋白酶，与其他血红蛋白酶类相同其也以血红素为辅基。其之所以命名为细胞色素 P450，是因为还原型细胞色素 P450 易与一氧化碳结合，且能生成一复合物，这种复合物在 450nm 处有一吸收峰。细胞色素 P450 酶系中的酶类主要在内质网、微粒体、线粒体等于物质代谢相关的细胞器膜和质膜分布，其主要以膜结合和可溶性两种形态存在[1]。细胞色素 P450 酶系的催化作用得以实现，依赖于电子供体 NADPH，细胞色素 P450 酶具有通过 2 个辅基 FAD 和 FMN 从 NADPH 转移电子的能力[2]。细胞色素 P450 酶系所催化的反应可简单表示如下：NADPH + H++ O2+ RH = NADP++ H2O + ROH，其中，R 表示底物，如甾体、脂肪酸或带有烯烃、烷烃、芳香环或杂环取代基的化合物，常作为氧化作用的位点[3]。生物体内生物活性小分子的生成、外援物质如药物代谢等都离不开这一反应，因此对于生物体而言该反应具有非常重要的作用。已有研究证明，这一反应为细胞色素 P450 酶系在体内发挥诸多功能例如烷基的羟化，烯基的环氧化，烃基的氧化等[4]的基础反应。细胞色素 P450 酶系参与多种反应，其作用底物多种且催化反应种类也多种，这一特点使其成为是很多内源性和外源性物质代谢反应过程中的关键酶系[5]。 .. 1.2斑马鱼细胞色素 P450 研究进展 细胞色素 P450 超基因家族是一类编码参与一些内源性物质(如激素、胆固醇)和外源性物质（如药物、环境化合物）代谢的酶系的超基因家族[33]。细胞色素 P450 基因家族是一个成员数目巨大的庞大的家族，该基因超家族约有 100 个家族，包括 600 多个成员，广泛存在与动物、植物、微生物的各种组织中。为了好区分数目庞大的细胞色素 P450 基因以及方便对其进行研究，细胞色素 P450 基因家族被分为多个家族、亚家族，其分类的主要依据为细胞色素 P450 基因家编码的蛋白质的氨基序列之间的同源性。氨基酸序列的同源性达到 40%以上即可归类为一个家族，氨基酸序列的同源性达到 55%以上即可归类为一个亚家族[34]。细胞色素 P450 基因的表示，以英文字母 CYP 代表，家族以 CYP 后的阿拉伯数字代表，而亚家族以阿拉伯数字后的大写字母表示，例如 CYP1A 等。斑马鱼中共存在 94 种 CYP 基因，分布于 18 个基因家族，而且这些基因家族同样存在于人类和哺乳动物，与人类 CYP 基因相同，斑马鱼 CYP 基因按其功能可分为两类：一类是与内分泌相关的基因CYP5-CYP51，另一类为外援物质代谢相关基因,CYP1-CYP3，以及稍相关的 CYP4 家族[35]。 2 材料与方法 2.1 实验材料 （1）焦碳酸二乙酯(DEPC)，EDTA-Na2，IPTG，X-gal，氨苄青霉素，蛋白酶 K，琼脂糖，Tris，蛋白胨，酵母粉，琼脂粉购自大连盈欣化学试剂有限公司； （2）异丙醇，氯仿，乙酸钠，无水乙醇，氢氧化钠，冰乙酸，氯化锰，氯化钙，氯化钠，氯化钾，盐酸,SDS，苦味酸，冰乙酸，甲醛，盐酸，二甲苯，石蜡，甘油，苏木精，伊红，中性树胶等购自大连沈联化学试剂玻璃仪器有限公司。 （3）TRizol 试剂，pUCM-T 载体，DL-2000 DNAMarker，SYBR Premix Ex TaqTMⅡKit (Tli RNaseH Plus)均购自 TakaRa（大连）公司，DH5alpha; 感受态由本实验室保存； （4）Taq DNA 聚合酶,PCR 回收试剂盒,质粒提取试剂盒, 6Loading buffer,实验所用引物均购自生工生物工程（上海）股份有限公司； （5）M-MLV 反转录酶购自天根生化科技（北京）有限公司。 . 2.2 实验方法 本实验室，水族箱规格 50cm35cm35cm。水族箱及其内部过滤设备等刚买回需用 3%高锰酸钾进行浸泡，然后用清水洗净。缸中用水草专用底泥种植水草，水草养殖半月左右，待缸内稳定方可将斑马鱼放入。此外，缸内水为经过曝气的自来水，水流自动循环，水中充氧，缸中置的加热棒，加热棒数目随室温增减，水温控制在 25℃左右。亲鱼每天投喂商品饵料（脱壳丰年虾卵），每天投喂 3 次，投喂时采用少量多次方法投喂，繁殖期间可以适当增加投喂量和投喂次数。亲鱼培育期间，保持水质良好，通过上部过滤器来保持水质的相对稳定。每周换水，换入的水为曝气 48 小时的自来水。斑马鱼在繁殖受光照周期影响，一般在早上日出后产卵。为促进斑马鱼的成熟，繁殖前注意水族箱上水草灯的开关时间。繁殖期间，可适当增加投喂次数，并且增加