流感病菌NA基因联合鸡Mx基因制备抗病转基因鸡的分析.docVIP

　　流感病菌NA基因联合鸡Mx基因制备抗病转基因鸡的分析 第一章文献综述 1多基因联合抵抗病毒研究进展 近年来，人们利用防御素基因、干扰素基因、干扰素受体基因、抗流感病毒基因、反义RNA、主要组织相容性复合体（MHC)基因、核酶、病毒衣壳蛋白基因和病毒中和性单克隆抗体基因的DNA或cDNA及核酶等导入细胞，使之获得抗病毒感染能力。在细胞或整体水平转移单个具有抗病性的外源基因进行遗传学改造、修饰是目前基因抗病的重要方式。但是如果同时转移并表达多个抗病性外源基因在基因抗病领域具有更重要的应用价值。目前主要釆取两种途径:一是多个携带不同基因的独立载体系统同时转染祀细胞；二是在同一载体上构建、表达多个基因。构建多基因表达载体可提高转移及表达效率。共表达主要应用于两方面①表达异源多聚体蛋白的亚单位；②同时表达针对同一祀细胞的几种异源蛋白以取得联合或协同的作用。 目前有关多个抗病基因通过联合表达发挥功能的报道表明它有很好的应用前景。2002年,811_等[1]用一种多价卵内疫苗进行鸡胚免疫，该疫苗包含有马立克氏病病毒（MDV)、传染性法氏囊病病毒（IBDV)和表达鸡新城疫病毒(NDV)血凝素神经氨酸酶（HN)和融合蛋白（F)的重组鸡痘病毒（FPV)载体，证实该重组疫苗能有效诱导实验鸡的体液免疫和细胞免疫,对IBDV、NDV和FPV的攻击的保护率分别为100%、81%和86%,对鸡胚的孵化率亦没有明显影响。2003年，许立华等人[2]将流感病毒血凝素基因(HA基因)及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白基因(N基因)联合表达，该联合表达产物中的血凝素(HA)可与HA单抗特异性结合，在此基础上建立乳胶凝集试验，很大程度上地提高了反应的特异性和灵敏性。2004年，Dus等[3]将口蹄疫病毒（FMDV)编码结构蛋白的P1基因和编码蛋白酶的3C基因作为免疫原基因导入苜猜生产转基因植株,之后免疫小鼠产生了特异性抗体并能抵抗强毒的攻击。Zheng M等[4]将蛋白酶3C基因和O/NY00衣壳蛋白P1共同插入到鸡痘病毒载体中,构建重组鸡痘病毒VUTAL3CP1，表达产物用来免疫小鼠和膝鼠,结果证明这重组鸡痘病毒可以诱导小鼠和部分膝鼠产生明显的细胞免疫和体液免疫反应。陈红英等人[5]2010年探索鸡新城疫病毒(NDV) F蛋白的免疫原性及鸡白细胞介素-18 ( IL-18)的免疫增强作用,结果表明,质粒pcDNA-F与pIL-18联合免疫显著提高鸡体的细胞免疫水平,并且提供了 50%免疫保护，这为NDV的防治开辟了新的途径。因此选择共同拥有抗病毒作用的基因,进行联合基因抗病,是抗性基因发挥抗病作用的一大发展方向。 2神经氨酸酶基因及其蛋白的研究进展 神经氣酸酶(Neuraminidase，NA)是流感病毒表面的一种物质，具有酶切活性，能够使病毒本身从细胞表面脱落下来[6]。 2.1神经氨酸酶的结构 神经氨酸酶又叫唾液酸酶(sialidase, SA)，是存在于流感病毒A和B表面的II型糖蛋白，其酶学代码为EC3.2.1.18,在病毒的生命活动中起关键酶的作用[7]。NA是一个由四个单体亚基组合而呈蘑燕状的四聚体，二硫键连接相邻的两个亚基，每两对单体组成一个四聚体,结构如图1-1 单体分为头部和莲部两部分。神经氨酸酶的活性部位是头部，大小为10 nmxlO nmx6mn,颈部则负责连接四聚体蛋白和病毒包膜。在每一个流感病毒的表面都分布着大约100个表面糖蛋白四聚体，NA的一级结构包括4个区域，分别为氨基酸端胞装尾、非极性跨膜区、莲部和盒子状头部。 每个NA单体由470个氨基酸组成，从N端到C端依次由胞内域、跨膜区、莲部和头部4个部分组成。胞内域是由6个氨基酸组成并且在所有流感病毒内是非常保守的，它的作用是影响病毒的组装和出芽，影响NA蛋白的稳定性及病毒的毒力，控制流感病毒颗粒的形状29个氨基酸残基组成的疏水性跨膜区，是NA蛋白转移至内质网的信号肽，将NA固定于膜上莲部在不同流感病毒中的长度是不一样的，约为62-82个氨基酸不等，主要作用是连接NA头部与跨膜区，其长度会影响NA酶活性的发挥头部约为390个氨基酸包括醇活性位点、抗原决定簇和部分糖基化位点。Colman等于1983年通过X射线衍射实验第一个测定了流感病毒NA头部的三维结构。NA的每个亚基是由六个四条反向平行肽链组成的P折叠结构构成的，这些折叠以单体的中心为轴线逆时针排列，每个亚基的中心都有一定数量的保守氨基酸序列，它们位于各亚基表面的口袋中，形成酶的活性位点。 第二章NA、Mx基因的克隆及其真核双表达载体构建 Mx(myxo-irus resistance)基因,即抗點液病毒基因,是由Lindenmann[3i]等在小鼠抗流感病毒研究中发现的，该基因有独特的抗禽流感病毒作用。Mx蛋白是M